Comparación de dos protocolos de extracción de ADN para la detección de infección por Plasmodium spp. en Anopheles spp.

Abstract

ABSTRACT: Detection of anophelines infected with Plasmodium spp. has traditionally been conducted by optical microscopy and immuno-assays. Currently, methodologies based on Polymerase Chain Reaction (PCR), provide high sensitivity and specificity; however, some authors have reported that inhibitors present in the mosquito’s body can decrease PCR sensitivity for Plasmodium spp. detection and that their effect could be reduced using DNA extraction protocols that efficiently remove those potential inhibitors. Objective To compare two DNA extraction protocols for the detection of Plasmodium spp. infecting Anopheles spp. Materials and methods Ten Anopheles stephensi mosquitoes infected with Plasmodium falciparum were dissected to separate head-thorax and abdomen and processed by one of the extraction protocols, dilutions of the DNA were evaluated by nested PCR. Differences between amplification frequencies were analyzed by the t-Student’s test and the hypotheses were analyzed by the test of difference between proportions of two populations. Results In specimens with DNA extracted by the protocol without chelating resin amplification of parasite DNA was achieved in 11.6% of the samples and with the protocol with chelating resin, in 6.6%. From all of the amplifications, 20% corresponded to undiluted DNA and 7.5% to DNA diluted 1:10; the difference between amplification proportions was statistically significant (p <0.05). Conclusions The protocol that more efficiently detected parasite DNA in mosquitoes was the one without chelating resin; with it, amplification was approximately two fold to the one obtained with the protocol with resin.

RESUMEN: La detección de anofelinos infectados por Plasmodium spp. se ha realizado tradicionalmente por medio de microscopia óptica e inmunoensayos. Actualmente, las metodologías basadas en la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), proveen una alta sensibilidad y especificidad; sin embargo, algunos autores han reportado que inhibidores, presentes en el cuerpo del mosquito, pueden disminuir la sensibilidad de la PCR para la detección de Plasmodium spp., y tal efecto podría reducirse con la utilización de protocolos de extracción de ADN que remuevan de forma eficiente los inhibidores potenciales. Objetivo Comparar dos protocolos de extracción de ADN para la detección de infección por Plasmodium spp. en Anopheles spp. Materiales y métodos Se seleccionaron diez mosquitos Anopheles stephensi infectados con Plasmodium falciparum, previamente disectados, para separar cabeza-tórax de abdomen, que fueron evaluados por dos protocolos de extracción: uno con resina quelante y otro sin resina; se realizaron diluciones del producto de extracción y se amplificó el DNA por PCR anidada. Se compararon las diferencias entre las frecuencias de amplificación mediante la prueba t-Student y las hipótesis fueron probadas aplicando la prueba de diferencia entre las proporciones de dos poblaciones. Resultados En especímenes cuyo ADN fue extraído usando el protocolo sin resina quelante la amplificación de ADN del parásito fue de 11,6%, y con el protocolo con resina fue 6,6%. Del total de las amplificaciones, un 20% correspondieron a material de extracción sin dilución y un 7,5% a material de extracción diluido 1:10; la diferencia entre las proporciones de amplificación fue estadísticamente significativa (p<0,05). Conclusiones El protocolo que con mayor eficiencia permitió detectar ADN del parásito en ADN extraído de mosquitos fue aquel al que no se añadió resina quelante; con este, la amplificación fue aproximadamente dos veces mayor que con el protocolo con resina.