Mejoramiento de la producción de ácido clavulánico mediante el cultivo de Streptomyces clavuligerus en fermentación extractiva, usando biorreactores operados en lote alimentado.

Abstract

RESUMEN: El ácido clavulánico (AC), es un potente inhibidor de enzimas β–lactamasas, y es obtenido mediante el cultivo del actinomiceto Streptomyces clavuligerus (S. clavuligerus) (Saudagar, Survase, & Singhal, 2008). La producción de AC a escala industrial es tradicionalmente llevada a cabo en biorreactores de tanque agitado, donde el modo de operación ha demostrado ser un factor determinante para la obtención de altos rendimientos de producto (Neto et al., 2005). El desarrollo de fermentaciones en reactores operados en lote alimentado ha sido reportado como la mejor estrategia para la síntesis de AC, alcanzando concentraciones mayores a 1000 mg/L (Bellao, Antonio, Araujo, & Badino, 2013); sin embargo, no existe un consenso acerca de las condiciones óptimas de operación tales como diseño de medios, velocidad de suministro de sustrato, agitación, temperatura y aireación, que permitan alcanzar una alta concentración de producto. De otra parte, los elevados costos asociados a las operaciones de separación/purificación del producto dejan ver la necesidad de contar con alternativas económicas para la recuperación del AC. En este sentido, la inclusión de resinas de intercambio iónico en el proceso productivo, ha promovido altos porcentajes de extracción, lo que ayuda a prevenir su degradación (Costa & Colli, 2015). En el presente estudio, se determinaron las condiciones nutricionales y medioambientales que favorecen la biosíntesis de AC, al igual que las mejores condiciones de temperatura, agitación y aireación, en fermentaciones a escala de matraz y de reactor de laboratorio (operado en lote y lote alimentado). Asimismo, se realizaron ensayos de separación y purificación de AC mediante la resina amberlita IRA 400 y, a partir de un diseño experimental, fue posible conocer el efecto de variables como pH, temperatura (isotermas de adsorción), relación sólido/líquido, cinéticas de adsorción y desorción, sobre el porcentaje de separación de AC. Asimismo, se encontró que los medios a base de proteína aislada de soya y concentraciones de glicerol de al menos 15 g/L favorecen la síntesis de AC, permitiendo niveles de producción de hasta 340 mg/L, tanto en cultivos en matraz como en cultivos en reactor de laboratorio. Adicionalmente, el modo de operación por lote alimentado, mediante pulsos de glicerol o suministro semi–continuo, incrementó la producción de AC hasta 4 veces respecto a cultivos operados en lote. Por último, la implementación de una estrategia de fermentación extractiva permitió obtener un máximo porcentaje adsorción de AC cercano al 55%; la máxima desorción fue del 65%. Finalmente, las isotermas de adsorción demostraron que, a bajas temperaturas (cercanas a 10°C), se beneficia el proceso de recuperación de AC. De esta manera, la estrategia de operación de reactor de laboratorio en lote alimentado por pulsos o suministro semi–continuo constituye una alternativa promisoria para la producción de AC, usando medios de cultivo enriquecidos a base de proteína aislada de soya; igualmente, la estrategia de recuperación de producto usando resina de intercambio iónico, constituye una alternativa viable en la formulación de sistemas de producción–recuperación simultánea de ácido clavulánico.

ABSTRACT: Clavulanic acid (AC) is a potent inhibitor of β–lactamase enzymes, and it is obtained by culturing the actinomycete Streptomyces clavuligerus (S. clavuligerus). AC production at industrial scale is traditionally carried out in stirred tank bioreactors, where the mode of operation has been proven to be a determining factor in obtaining high product yields. The development of fermentations in reactors operated in fed–batch has been reported as the best strategy for the synthesis of AC, reaching concentrations greater than 1000 mg/L; however, there is no consensus on the optimal operating conditions that allow reaching a high product concentration such as media design, substrate supply speed, agitation, temperature and aeration. On the other hand, the high costs associated with the separation/purification operations of the product reveal the need for economic alternatives for the recovery of AC. In this sense, the inclusion of ion exchange resins in the production process has promoted high extraction percentages, which helps to prevent their degradation. In the present study, the nutritional and environmental conditions that favor CA biosynthesis were determined, as well as the best conditions of temperature, stirring and aeration, in flask and laboratory reactor scale fermentations (operated in batch and fed–batch). Likewise, AC separation and purification tests were carried out using the resin amberlite IRA 400 and it was possible to know the effect of variables such as pH, temperature (adsorption isotherms), solid/liquid ratio, and kinetics of adsorption and desorption, on the percentage of AC separation. It was found that the media based on isolated soybean protein and glycerol concentrations of at least 15 g/L favor the synthesis of AC, allowing production levels of up to 340 mg/L, both in flask and reactor cultures. Additionally, the fed–batch mode of operation, by means of glycerol pulses or semi–continuous supply, increased AC production up to 4 times compared to batchoperated crops. Lastly, the implementation of an extractive fermentation strategy allowed obtaining a maximum AC adsorption percentage close to 55%; the maximum desorption was 65%. Finally, the adsorption isotherms showed that, at low temperatures (close to 10°C), the AC recovery process was benefited. In this way, the operating strategy of a batch laboratory reactor fed by pulses or semi–continuous supply constitutes a promising alternative for the production of AC, using enriched culture media based on isolated soy protein; likewise, the product recovery strategy using ion exchange resin constitutes a viable alternative in the formulation of clavulanic acid production–simultaneous recovery systems.