Quality of cocoa (Theobroma cacao L.) DNA from foliar tissue at different stages of development

Abstract

ABSTRACT: Theobroma cacao L. and its products are consumed worldwide. Those products are of great research interest due to antioxidant properties of some of their polyphenolic constituents. The amount of these polyphenols and polysaccharides has shown that can interfere with the high quality and quantity of nucleic acids for molecular research. Therefore, cocoa DNA extraction protocols can require a large amount of plant material and optimization time according with plant material source. The aim of this study was to evaluate the quality and quantity of DNA isolated from field plant leaves at different developmental stages from TSH565 genotype using different DNA extraction protocols. In addition, DNA extraction protocol was evaluated for small amount of young leaf tissue collected from in vitro plantlets from CCN51 and TSH565 genotype. Subsequently, the selectivity of different polymerase enzymes for PCR amplification using the obtained DNA was evaluated. This study revealed that D stage of development in field leaves was efficient for extraction of high-quality genomic DNA using the PowerPlant® Pro Kit modified (183.80 ng.μL-1 (1.98 A260/A280-1.98 A260/A230)). Highest DNA concentrations were obtained for FPL with 128.68 ng.μL-1 and 114.42 ng.μL-1 for CCN51 and TSH565 respectively and with IVL, which was obtained 54.24 ng.μL-1 for CCN51 and 56.52 ng.μL-1 for TSH565 per 0.1 g of leaf tissue. Taq DNA Polymerase recombinant of Thermo Scientific® showed the highest performance specifically for this study, contributing to the undoubted amplification of molecular markers like microsatellites (SSRs). The results obtained have allowed improvements in genetic analyses and molecular studies using a reduced amount of plant tissue.

RESUMEN: Theobroma cacaoL. y sus productos se consumen en todo el mundo. Esos productos son de gran interés para la investigación debido a las propiedades antioxidantes de algunos de sus componentes polifenólicos. La cantidad de estos polifenoles y polisacáridos ha demostrado que puede interferir con la alta calidad y cantidad de ácidos nucleicos para la investigación molecular. Por lo tanto, los protocolos de extracción de ADN de cacao pueden requerir una gran cantidad de material vegetal y tiempo de optimización de acuerdo con la fuente de origen del material vegetal. El objetivo de este estudio fue evaluar la calidad y la cantidad de ADN aislado de hojas de plantas de campo en diferentes etapas de desarrollo a partir del genotipoTSH565utilizando diferentes protocolos de extracción de ADN. Además, se evaluó el protocolo de extracción de ADN para una pequeña cantidad de tejido foliar joven recogido de plántulas in vitro de genotipoCCN51yTSH565. Posteriormente, se evaluó la selectividad de diferentes enzimas polimerasas para la amplificación por PCR usando el ADN obtenido. Este estudio reveló que la etapa D del desarrollo foliar en condiciones de campo fue eficiente para la extracción de ADN genómico de alta calidad usando el kit PowerPlant® Pro modificado (183.80 ng.μL-1 (1.98 A260 / A280-1.98 A260 / A230)). Las concentraciones más altas de ADN se obtuvieron para FPL con 128.68 ng.μL-1 y 114.42 ng.μL-1 paraCCN51yTSH565, respectivamente y con IVL, que se obtuvo 54.24 ng.μL-1 paraCCN51y 56.52 ng.μL-1 paraTSH565por 0.1 g de tejido foliar. Taq ADN polimerasa recombinante de Thermo Scientific® mostró el mayor rendimiento específicamente para este estudio, lo que contribuye a la amplificación indudable de marcadores moleculares como los microsatélites (SSR). Los resultados obtenidos han permitido mejoras en análisis genéticos y estudios moleculares utilizando una cantidad reducida de tejido vegetal.