Identificacion molecular de Listeria monocytogenes en matrices cárnicas

Abstract

RESUMEN : Listeria monocytogenes es un importante patógeno asociado a enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), que produce una infección llamada listeriosis, adquirida por el consumo de alimentos contaminados: carnes, leches, queso, frutas, ensaladas y pescado. Dentro de la población más susceptible a adquirir esta infección están los ancianos, recién nacidos, mujeres en embarazo y, en general, pacientes con compromiso de la inmunidad celular.Este microorganismo posee características que lo convierten en un importante contaminante de alimentos; su hábitat es el suelo donde permanece de manera saprofita y pueden llegar a los alimentos. Los métodos que actualmente se utilizan para la tamización se basan en técnicas de ausencia/presencia que involucran varios pasos de enriquecimiento y confirmación con pruebas bioquímicas que tardan 15 días en arrojar resultados. Este método no permite tomar decisiones rápidas en la industria de alimentos, lo cual causaa incrementos en el tiempo de liberación de productos. Es por esto que el control microbiológico de los alimentos exige técnicas que sean altamente sensibles y específicas, pero que, además, sean rápidas y permitan ejercer un seguimiento en la línea de producción de todo tipo de alimento. Las técnicas moleculares han cobrado gran fuerza en los últimos años como alternativa a los métodos convencionales de detección, aportando una mayor sensibilidad y especificidad; una de las técnicas más utilizadas es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La implementación de la PCR como herramienta de detección elimina las ambigüedades en los resultados de un estudio microbiológico, reportando específicamente el género y especie bacteriana presente en la muestra. La estandarización de técnicas moleculares para la detección de microorganismos a partir de matrices alimenticias exige la evaluación de diferentes métodos de extracción del ADN bacteriano para determinar el mejor desempeño en la realización de la PCR de acuerdo a cada alimento evaluado.Para matrices cárnicas se han evaluado diferentes métodos de extracción de ADN que involucran lisis celular por choque térmico, purificación con solventes orgánicos y concentración del material extraído. Luego de analizar los resultados de la evaluación de los diferentes protocolos de extracción de ADN y su influencia sobre la reacción de PCR múltiple para la identificación de Listeria spp. y específicamente L. monocytogenes, basada en la identificación de una región conservada del gen de la subunidad 16S rRNA y el gen hlyA, se determinó que cualquiera de los métodos de extracción de ADN evaluados puede ser aplicado al protocolo de identificación molecular, todos los métodos arrojaron muestras de calidad adecuada para permitir la amplificación de los dos fragmentos esperados. En dirección a reducir tiempo de procesamiento, uso de reactivos costosos y potencialmente tóxicos, se adoptó el método de extracción simple con PBS + Tween 20 como el método de extracción de ADN óptimo para el desarrollo de un protocolo de identificación de rutina de alimentos contaminados con Listeria spp. y Listeria monocytogenes. Este método es fácilmente aplicable, no se requiere una disposición especial del material de descarte, además el tiempo de procesamiento de las muestras se reduce considerablemente a solo una hora.