Estrategias para el desarrollo de nuevas herramientas para la edición genética en Paracoccidioides spp.: un acercamiento a la tecnología CRISPR/Cas9

Abstract

RESUMEN: El hongo Paracoccidioides spp. es el agente causal de la Paracoccidioidomicosis (PCM) una enfermedad humana endémica en Latino América. El conocimiento sobre los eventos moleculares implicados en su patogenicidad y virulencia es limitado, esto debido a la dificultad para realizar el bloqueo total de la expresión de genes mediante el uso de las técnicas de edición genética tradicionales. La tecnología CRSISPR/Cas9 se caracteriza por la simplicidad y especificidad del sistema para ejecutar el corte de la doble cadena de ADN. Sin embargo, una variedad de estudios muestra la necesidad de adaptar la metodología empleada a las características biológicas de cada modelo en estudio. En este trabajo se estudiaron dos estrategias para implementar la tecnología CRISPR/Cas9 en P. restrepiensis. i) Inicialmente se usó la transformación mediada por A. tumefaciens para la inserción en el genoma del hongo de un sistema para la expresión de la proteína Cas9 y el ARN guía; a pesar de realizar una transfección exitosa, no se observó producción del RNA del gen cas9. ii) En la segunda parte se utilizaron complejos de ribonucleoproteínas (RNPs) formados por la proteína Cas9 y ARN guía recombinantes, ensayos en los cuales se confirmó la especificidad de corte en el ADN de P. restrepiensis in vitro, y la necesidad de ajustar los protocolos de transformación para el uso de esta metodología in vivo. iii) Adicionalmente, se evaluó el casete KanMX como nuevo marcador de selección dominante, encontrando su utilidad para los estudios genéticos de este patógeno.

ABSTRACT: Paracoccidioides spp. are causative agents of Paracoccidioidomycosis (PCM), an endemic human disease to Latin America. The knowledge about the molecular events related with its pathogenicity and virulence are limited, due to difficulties to perform knockout gene mutations, through traditional genetic edition methodologies. CRISPR/Cas9 technology is a simple and specificity technic to carry out doble strain DNA breaks. However, a variety of studies showed the requirement to adapt the methodology for each biological model. This work studied two strategies to apply the CRISPR/Cas9 technology in P. restrepiensis. i) First, we used the A. tumefaciens mediated transformation to insert the Cas9 protein and RNA guide expression system into the fungus genome, although the transfection was successful, we did not observe a cas9 gene mRNA production. ii) In the second part we used ribonucleoprotein complexes of recombinant Cas9 protein and RNA guide, our assays confirmed the specificity cut on P. restrepiensis DNA in vitro as well the necessity to set this methodology in in vivo assays. iii) Furthermore, we evaluated the KanMX cassette as a new dominant selection marker, we found its utility for genetic studies in this pathogen.