Evaluación de los efectos del material particulado PM10 de la ciudad de Medellín en la respuesta mediada por neutrófilos

Abstract

ABSTRACT: The epidemiological association between exposure to particulate matter (PM10) and various respiratory and cardiovascular problems is well known, but the mechanisms driving these effects remain unclear. Neutrophils play an essential role in immune defense against foreign agents and also participate in the development of inflammatory responses. However, the role of these cells in the PM10 induced inflammatory response is not yet fully established. Thus, this study aims to evaluate the effect of PM10 on the neutrophil-mediated inflammatory response. For this, neutrophils from healthy adult human donors were in vitro exposed to different concentrations of PM10. The cell viability and cytotoxic activity were evaluated by MTT. LDH, propidium iodide and reactive oxygen species (ROS) were quantified by flow cytometry. Interleukin 8 (IL-8) expression, peptidyl arginine deiminase 4 (PAD4), myeloperoxidase (MPO), and neutrophil elastase (NE) expression were measured by RT-PCR. IL-8 was also quantified by ELISA. Fluorescence microscopy was used to evaluate neutrophil extracellular traps (NETs) release. The in vivo inflammatory responses were assessed in BALB/c mice exposed to PM10 by histopathology and RT-PCR. The analysis shows that PM10 exposure induced a cytotoxic effect on neutrophils, evidenced by necrosis and LDH release at high PM10 concentrations. ROS production, IL-8, MPO, NE expression, and NETs release were increased at all PM10 concentrations assessed. Neutrophil infiltration in bronchoalveolar lavage fluid (BALF), histopathological changes with inflammatory cell infiltration, and CXCL1 expression were observed in PM10-treated mice. The results suggest that lung inflammation in response to PM10 could be mediated by neutrophils activation. In this case, these cells migrate to the lungs and release pro-inflamatory mediators, including ROS, IL-8, and NETs. Thus, contributing to the exacerbation of respiratory pathologies, such as allergies, infectious and obstructive diseases.

RESUMEN: RESUMEN: Uno de los contaminantes atmosféricos más relevantes por sus efectos adversos para la salud, es el material particulado (PM) con un diámetro menor a 10 micras, ya que puede penetrar profundamente en los pulmones e inducir respuestas inflamatorias con la sobreactivación de neutrófilos, principal población celular que migra a los sitios de inflamación del pulmón, llevando al desarrollo de diversas enfermedades del sistema respiratorio. La mayoría de estos contaminantes son el producto de la quema de combustibles fósiles, pero su composición puede variar según sus fuentes. En el desarrollo de esta tesis se muestran los resultados de la evaluación de los efectos del material particulado PM10 de la ciudad de Medellín en la respuesta inflamatoria mediada por neutrófilos. En el Capítulo 1, se presentan los resultados de un trabajo publicado en la revista Heliyon, en el cual se revisó sistemáticamente las investigaciones disponibles que han evaluado el efecto de los contaminantes atmosféricos en la respuesta mediada por neutrófilos en modelos in vivo e in vitro, en el período 1980-2020. Una de las principales conclusiones sugirió que los contaminantes ambientales inducen el reclutamiento de neutrófilos como primer signo de inflamación, y que posteriormente estas células liberan citoquinas proinflamatorias y radicales libres de oxígeno (ROS) que dependen del tipo de contaminante. En el Capítulo 2, se presentan los resultados de un trabajo publicado en la revista Scientific Reports, en el cual se muestra la evaluación experimental in vitro del efecto del PM10 sobre neutrófilos obtenidos de individuos humanos sanos. Las células fueron estimuladas con diferentes concentraciones de PM10, se evaluó la citotoxicidad y viabilidad celular, y se cuantificó los siguientes mediadores inflamatorios, i) radicales libres de oxígeno mediante citometría de flujo ii) producción de interleucina 8 (IL-8) por RT-PCR en tiempo real y ELISA iii) la expresión de peptidil arginina deiminasa 4 (PAD4), mieloperoxidasa (MPO) y elastasa de neutrófilos (NE) por RT-PCR en tiempo real, y iv) la inducción de netosis por microscopía de fluorescencia. Adicionalmente, se presentan los resultados del análisis experimental del efecto de la exposición de PM10 en un modelo murino. En este caso, ratones BALB/c fueron expuestos a PM10 y posteriormente en el lavado broncoalevolar (BALF) se realizó recuentos diferenciales para neutrófilos y en los tejidos pulmonares, análisis histopatológico y expresión de la quimiocina (CXCL1) con el fin de evaluar la infiltración de neutrófilos. Finalmente se presentan las conclusiones generales y con base en los resultados experimentales obtenidos, más los resultados obtenidos en la revisión sistemática de literatura, proponemos que los neutrófilos se infiltran rápidamente en el pulmón e inician respuestas inflamatorias mediante varios mecanismos que incluyen, producción de ROS, producción de IL-8, liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) y la liberación de múltiples enzimas proteolíticas, como MPO y NE.