Estandarización de una PCR en tiempo real para evaluar la expresión de genes implicados en la diferenciación de células estromales mesenquimales infectadas con Histoplasma capsulatum

Abstract

RESUMEN: Las células estromales mesenquimales (MSC, por sus siglas en inglés) son cada vez más utilizadas en la terapia regenerativa por su potencial de diferenciación a diferentes linajes celulares. El objetivo de este trabajo fue estandarizar una PCR en tiempo real para determinar si la infección, in vitro, con levaduras de Histoplasma capsulatum afecta el proceso de diferenciación de las MSCs, a través de la evaluación de la expresión de genes asociado con la diferenciación a adipocitos (genes que codifican para adiponectina y lipoproteinlipasa) y osteocitos (genes que codifican para la proteína factor de transcripción 2 relacionado con Runt (RUNX2) y osteocalcina). Las MSCs fueron cultivadas en medios de cultivo especiales que contenían cocteles de moléculas que inducen la diferenciación hacia linaje adipogénico y osteogénico, e incubadas a tres tiempos diferentes (0, 2 y 4 semanas), para luego ser infectadas con levaduras de Histoplasma capsulatum e incubadas nuevamente por 24 horas, para después realizar una extracción del RNA por el método fenol cloroformo y, finalmente realizar una PCR en tiempo real (qPCR). Para la qPCR se utilizaron cinco pares de primers, uno para cada gen a evaluar y otro para el gen gliceraldehido 3-fostafo deshidrogenasa (GAPDH) como gen constitutivo o normalizador. Al analizar los datos arrojados por la PCR se pudo observar que la expresión relativa de genes asociados al proceso de adipogénesis disminuyó significativamente cuando las MSCs se infectaron con las levaduras del hongo, por el contrario, los genes asociados al proceso de osteogénesis aumentaron su expresión cuando estas fueron infectadas. Los anteriores resultados permiten concluir que H. capsulatum afecta el proceso de diferenciación de las células estromales mesenquimales hacia los linajes adipogénicos y osteogénicos. Mas estudios son necesarios para evaluar las implicaciones de estos hallazgos