Genetic dissection of inborn errors of immunity in Colombian patients with severe infectious diseases: lessons from patients with single to multiples infections

Abstract

ABSTRACT: INTRODUCTION: Human genetics of infectious diseases propose that monogenic inborn errors of immunity (IEI) underlying resistance or susceptibility to specific infections. Life-threatening infectious diseases in otherwise healthy children, adolescents, and even young adults have been attributed to single-gene IEI. We aim to characterize a cohort of 53 Colombian patients with severe fungal, mycobacterial, virus and bacterial infections with the hypothesis that those patients potentially carriers an IEI underlying their clinical phenotypes. METHODS: Written informed consent was obtained from the patients and their relatives included in this study. Medical, immunological, and microbiological data of the patients were examined. We established pedigrees using patients and family information. Samples (from blood, skin, saliva) were obtained to perform whole-exome sequencing (WES) and Sanger sequencing to detect mutations in previously known or unknown IEI-causing genes or mechanism. Analysis of mRNA expression, protein expression and functional studies were performed according with the findings to prove the causality. We also explored by ELISA the presence of anti-GM-CSF or anti-IFN-γ auto-Abs. RESULTS: We studied 53 Colombian patients from 49 unrelated kindreds presented with severe infectious diseases. Consanguinity was claimed in 4 kindred. We performed 42 WES and we found a disease-causing gene or disease-causing mechanism in 43% of the cohort (23/53). All variants were verified by sanger sequencing and X-linked (XL), autosomal dominant (AD) or autosomal recessive (AR) inheritance was confirmed. First, we studied 2 patients with invasive Ascomycetes fungal infections carrying biallelic CARD9 mutations (n=2) abolishing the CARD9 protein expression. Secondly, we found neutralizing GM-CSF autoantibodies in three patients suffering by disseminated cryptococcosis (n=3). Third, we deeply characterized 2 patients with invasive fungal (histoplasmosis and cryptococcosis), chronic cutaneous warts, and mycobacterial disease presenting with biallelic loss of function (LoF) mutations in IL7 (n=2). In addition, we found 4 patients with Mendelian susceptibility to mycobacterial diseases (MSMD) (n=4), 10 patients with chronic granulomatous diseases (CGD) (n=10), and 2 patients with tuberculosis and listeriosis carrying a biallelic TNF mutation (n=2). CONCLUSIONS: We characterize a cohort of Colombian patients with IEI underlying severe infectious diseases. We obtained important lessons studying fungal infections: First, we report biallelic CARD9 mutations in patients with invasive phaeohyphomicosis. Second, we identified a cohort of patients presenting disseminated cryptococcosis due to neutralizing antiGM-CSF autoantibodies. Third, we performed for the first-time a comprehensive and deep characterization of patients with inherited AR IL-7 deficiency. Fourth, we describe a cohort of MSMD and CGD patients from Colombia. Finally, we discovered, and we will report for the first time a TNF defect in patients presenting tuberculosis. The work performed during this thesis is the first complete characterization of Colombian patients with IEI underlying infections diseases based on WES or anti-cytokine auto-Abs screening.

RESUMEN: INTRODUCCIÓN: La genética humana de las enfermedades infecciosas propone que los errores innatos de la inmunidad (EII) generan resistencia o susceptibilidad a infecciones. Las enfermedades infecciosas potencialmente mortales en niños, adolescentes e incluso adultos jóvenes sanos se han atribuido a IEI. Nuestro objetivo es caracterizar una cohorte de 53 pacientes colombianos con infecciones graves por hongos, micobacterias, virus y bacterias con la hipótesis de que esos pacientes son potencialmente portadores de una IEI subyacente a sus fenotipos clínicos. MÉTODOS: Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes y sus familiares incluidos en este estudio. Se examinaron los datos médicos, inmunológicos y microbiológicos de los pacientes. Establecimos pedigríes utilizando información de pacientes y familiares. Se obtuvieron muestras (de sangre, piel, saliva) para realizar la secuenciación del exoma completo (WES) y la secuenciación de Sanger para detectar mutaciones en genes o mecanismos causantes de IEI previamente conocidos o desconocidos. Se realizaron análisis de expresión de ARNm, expresión de proteínas y estudios funcionales de acuerdo con los hallazgos para probar la causalidad. También exploramos por ELISA la presencia de auto-Abs anti-GM-CSF o anti-IFN-γ. RESULTADOS: Estudiamos a 53 pacientes colombianos de 49 familias no emparentadas que presentaban enfermedades infecciosas graves; entre ellos 4 eran falilias cosanguineas. Realizamos secuenciación completa por exoma en 42 pacientes y encontramos un gen causante de la enfermedad o un mecanismo causante de la enfermedad en el 43 % de la cohorte (23/53). Todas las variantes se verificaron mediante secuenciación de Sanger y se confirmó el tipo de herencia de la enfermedad, ligada al cromosoma X (XL), autosómica dominante (AD) o autosómica recesiva (AR). Primero, estudiamos a 2 pacientes con infecciones fúngicas invasivas de Ascomycetes que portaban mutaciones bialélicas de CARD9 (n = 2) que abolían la expresión de la proteína CARD9. En segundo lugar, encontramos autoanticuerpos neutralizantes a GM-CSF en tres pacientes que padecían criptococosis diseminada (n=3). En tercer lugar, caracterizamos profundamente a 2 pacientes con hongos invasivos (histoplasmosis y criptococosis), verrugas cutáneas crónicas y enfermedad micobacteriana que presentaban mutaciones bialélicas con pérdida de función en IL7 (n = 2). Además, encontramos 4 pacientes con susceptibilidad mendeliana a enfermedades micobacterianas (MSMD) (n=4), 10 pacientes con enfermedad granulomatosa crónica (EGC) (n=10) y 2 pacientes con tuberculosis y listeriosis portadores de una mutación bialélica en el gen TNF (n=2). CONCLUSIONES: Nosotros caracterizamos una cohorte de pacientes colombianos con IEI subyacente a enfermedades infecciosas graves. Obtuvimos lecciones importantes al estudiar las infecciones fúngicas: primero, informamos mutaciones bialélicas de CARD9 en pacientes con feohifomicosis invasiva. En segundo lugar, identificamos una cohorte de pacientes que presentaban criptococosis diseminada por autoanticuerpos neutralizantes antiGM-CSF. En tercer lugar, realizamos por primera vez una caracterización completa y profunda de pacientes con deficiencia AR hereditaria de IL-7. Cuarto, describimos una cohorte de pacientes colombianos con MSMD y EGC. Finalmente, descubrimos y reportaremos por primera vez un defecto en el gen TNF en pacientes que presentan tuberculosis. El trabajo realizado durante esta tesis es la primera caracterización completa de pacientes colombianos con enfermedades infecciosas que presenta IEI basados en análisis de secuenciación completa del exoma y búsqueda de autoanticuerpos anti-citocinas.