Desarrollo de inmunógenos recombinantes tipo fosfolipasa A2 y toxina de tres dedos para la producción de antiofídicos de interés clínico en Colombia

Abstract

RESUMEN: En Colombia, los envenenamientos producidos por los géneros Micrurus y Crotalus representan un problema de salud pública debido a los efectos neurotóxicos de sus venenos, y a la escasez de antivenenos. La producción y distribución de dichos biológicos para estas especies es limitada debido a la difícil obtención y disponibilidad de los venenos, y a la baja neutralización de los antivenenos polivalentes. En este sentido, el objetivo de esta investigación fue desarrollar inmunógenos recombinantes tipo fosfolipasa A2 (PLA2) y toxinas de tres dedos (3FTxs) para producir antivenenos en Colombia. La estrategia metodológica se basó en el diseño y síntesis de tres construcciones genéticas a partir de las secuencias de aminoácidos de α y β-neurotoxinas más abundantes de los venenos de Micrurus dumerilii, Micrurus mipartitus y Crotalus durissus terrificus, las cuales, fueron clonadas y expresadas en la cepa BL21 (DE3) de Escherichia coli, purificadas mediante distintos métodos cromatográficos, y caracterizadas biológicamente in vitro (actividad fosfolipasa A2, anticoagulante) e in vivo (letal, edematizante y miotóxica). Estas toxinas recombinantes fueron usadas en un esquema de inmunización animal para la producción de sueros hiperinmunes. Para evaluar los anticuerpos específicos generados, se monitoreó la respuesta inmune y el reconocimiento inmunológico mediante inmunoensayos de ELISA y Western blot. Además, se evaluó la capacidad neutralizante de los anticuerpos anti-toxina recombinante. Como resultados, se obtuvieron las toxinas recombinantes His-rMdumPLA2, HisrMipartoxin-1 y HisrCTX-CBb. Estas toxinas fueron detectadas por SDS-PAGE como cuerpos de inclusión y sus masas moleculares fueron ~17 kDa, ~11 kDa y ~17 kDa, respectivamente. His-rMdumPLA2, HisrMipartoxin-1 y HisrCTX-CBb se purificaron mediante RP-HPLC en tiempos de elución de 18.2, 16.0 y 17.3 minutos, respectivamente. Estas toxinas no evidenciaron efecto letal en ratón, pero presentaron reconocimiento inmunológico cruzado inter-especie. His-rMdumPLA2 y HisrCTX-CBb presentaron actividad biológica, mientras que His-rMdumPLA2 y HisrMipartoxin-1 fueron capaces de generar anticuerpos con capacidad neutralizante. Estos hallazgos sugieren su potencial como inmunógenos para la producción de antivenenos anti-coral y anti-crotálico.

ABSTRACT: Snake envenomations caused by Micrurus and Crotalus species pose a significant public health problem in Colombia due to the neurotoxic effects of their venoms and the limited availability of antivenoms. This research aimed to develop recombinant immunogens of phospholipase A2 (PLA2) and three-fingered toxins (3FTxs) for the production of antivenoms in Colombia. Genetic constructions were designed and synthesized based on the most abundant α and β-neurotoxin amino acid sequences from Micrurus dumerilii, Micrurus mipartitus, and Crotalus durissus terrificus venoms. These constructions were cloned and expressed in Escherichia coli strain BL21 (DE3) and subsequently purified using various chromatographic methods. The recombinant toxins were then characterized both in vitro (phospholipase A2 activity, anticoagulant effects) and in vivo (lethal, edematizing, and myotoxic effects). Hyperimmune sera were produced by immunizing animals with the recombinant toxins, and the generated antibodies were evaluated through ELISA and Western blot immunoassays. The neutralizing ability of the antibodies against the recombinant toxins was also assessed. Recombinant toxins, including His-rMdumPLA2, HisrMipartoxin-1, and HisrCTX-CBb, were successfully obtained. These toxins were detected as inclusion bodies on SDS-PAGE, with molecular masses of approximately 17 kDa, 11 kDa, and 17 kDa, respectively. His-rMdumPLA2, HisrMipartoxin-1, and HisrCTX-CBb were purified through RP-HPLC, eluting at 18.2, 16.0, and 17.3 minutes, respectively. While the recombinant toxins did not exhibit a lethal effect in mice, they demonstrated cross-intra-species immunological recognition. His-rMdumPLA2 and HisrCTX-CBb exhibited biological activity, and antibodies generated against His-rMdumPLA2 and HisrMipartoxin-1 showed neutralizing capacity. These findings suggest the potential of these recombinant toxins as immunogens to produce anti-coral and anti-crotalic antivenoms.