Desarrollo de líneas celulares tumorales humanas por ingeniería genética a partir de cultivos primarios de tejidos de antro y cavidad bucal

Abstract

RESUMEN: Introducción: El cáncer escamocelular de cabeza cuello (CECC) y el cáncer gástrico (CG) son los tumores de peor pronóstico por la heterogeneidad genética y la falta de modelos experimentales adecuados para realizar estudios funcionales. Las células humanas transformadas por ingeniería genética proporcionan una estrategia para evaluar la función de genes supresores de tumor (GST) y protooncogenes durante la carcinogénesis. Materiales y métodos: Se estandarizó un método mecánico-enzimático para aislar células epiteliales de mucosa de antro y tejido gingival de porcino y humano. Las condiciones del cultivo se optimizaron con factores de crecimiento y suplementos para mantener en genotipo y fenotipo epitelial hasta por 45 días. Vectores lentivirales que portaban oncogenes como transgén se diseñaron por mutagénesis dirigida en protooncogenes C-MYC, KRAS y CTNNB1; también, se diseñaron sondas de ARNA guía con el sistema CRISPR-Cas9 para inactivar GST TP53, APC, CDH-1MLH-1 y PTEN. Los cultivos primarios se modificaron secuencialmente con el coctel de sondas sintéticas de ARN guía CRISPR y la enzima Cas9 en liposomas para inactivar los GST en monocapas de células gástricas y gingivales. En un segundo ensayo, los lentivirus se adicionaron para sobre expresar los oncogenes e inducir tumorigénesis. El fenotipo y genotipo de las células primarias, células transformadas y la carcinogénesis se evaluaron con diferentes ensayos. Resultados: Un protocolo mecánico y enzimático se optimizó para aislar gastrocitos y células gingivales utilizando combinaciones de colagenasa I y dispasa II en presencia de inhibidor de la tripsina de soja y ditiotreitol para reducir el daño a la membrana plasmática y preservar la viabilidad celular durante la digestión del tejido. El medio William’s suplementado con factor de crecimiento epidermal, insulina, insulina-transferrina-selenio y suero bovino permitió conservar las características epitelial de los cultivos hasta por 45 días. Los gastrocitos no incorporaron las modificaciones genéticas con CRISPR Cas9 y lentivirus y la monocapa se desprendió totalmente 45-50 días pos aislamiento. Por el contrario, las células gingivales formaron monocapas policlonales inmortales y a partir de estas se aislaron tres monoclones transformados (CEGM1, CEGM2 y CEGM3) que se cultivaron hasta por 6 meses para luego conservarlos en nitrógeno líquido. La caracterización genotípica confirmó la expresión de genes de mucinas y sobre expresión de oncogenes; además, el fenotipo epitelial se demostró por la presencia de varias citoqueratinas ácidas y básicas por inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Finalmente, el ensayo de crecimiento independiente de anclaje, curva de crecimiento y cariotipo por bandeo G, confirmaron el fenotipo tumoral en los tres monoclones. Conclusiones: Dos protocolos diferentes se estandarizaron para aislar y cultivar gastrocitos y células gingivales epiteliales a partir de explantes, utilizando un método mecánico-enzimático. Se desarrolló el primer modelo de células tumorales de CECC por ingeniería genética en cultivos primarios humanos a partir de tejidos gingivales sanos. Se recomienda identificar los indels en GST inducidos con CRISPR, secuenciar el genoma y epigenoma y evaluar las carcinogénesis de las células gingivales inmortales en modelos murinos.

ABSTRACT: Introduction: Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and gastric cancer (GC) are the tumors with the worst prognosis due to genetic heterogeneity and lack of suitable experimental models for functional studies. Genetically engineered human cells provide a strategy to study the function of tumor suppressor genes (TSGs) and proto-oncogenes during carcinogenesis. Materials and methods: In this work, we standardized a mechanical-enzymatic method to isolate epithelial cells from human antral mucosa and gingival tissue. Culture conditions were optimized with growth factors to maintain epithelial genotype and phenotype for up to 45 days. Lentiviral vectors carrying oncogenes were designed by site-directed mutagenesis in the proto-oncogenes C-MYC, KRAS G12V and CTNNB1, and the CRISPR-Cas9 system was used to inactivate GST TP53, APC, CDH-1MLH-1 and PTEN. Primary cultures were sequentially modified with the synthetic CRISPR guide RNA probe cocktail and Cas9 enzyme in liposomes to inactivate GSTs in primary gastric and gingival cells. In a second assay, lentiviruses were added to overexpress exogenous oncogenes and induce tumorigenesis. The phenotype and genotype of primary cells, transformed cells and carcinogenesis were evaluated using various techniques. Results: A mechanical and enzymatic protocol was optimized to isolate gastrocytes and gingival cells using combinations of collagenase I and dispase II in the presence of soybean trypsin inhibitor and dithiothreitol to reduce plasma membrane damage and preserve cell viability during tissue digestion. William's medium supplemented with optimized concentrations of epidermal growth factor, insulin, insulin-transferrin-selenium, and bovine serum preserved the epithelial characteristics of the cultures for up to 45 days. Gastrocytes did not incorporate the CRISPR-Cas9 and lentivirus genetic modifications and died at day 45-50 post-isolation. In contrast, gingival cells formed an immortal polyclonal monolayer from which three transformed monoclonal cells (CEGM1, CEGM2 and CEGM3) were isolated and cultured for up to 6 months. Genotypic characterization confirmed the expression of mucin genes and overexpression of exogenous oncogenes; furthermore, the epithelial phenotype was demonstrated by the presence of several cytokeratins by immunohistochemistry and immunofluorescence. Finally, anchorage-independent growth assay, growth curve and karyotyping by G-banding confirmed the tumor phenotype in monoclones. Conclusions: Two different protocols were standardized to isolate and culture gastrocytes and gingival epithelial cells from explants using a mechano-enzymatic method. In addition, the first genetically engineered CECC tumor cell model was developed in human primary cultures from healthy gingival tissue. It is recommended to identify the CRISPR-induced indels in GST, sequence the genome and epigenome, and evaluate the carcinogenesis of immortalized gingival cells in mouse models.