Sistema optimizado para el cultivo y expansión de células HUVEC a partir de derivados plaquetarios

Abstract

RESUMEN: Los medios de cultivo deben suministrar los nutrientes y condiciones esenciales para el metabolismo, mantenimiento y proliferación celular. Los medios basales se complementan con frecuencia con sueros de origen animal, principalmente con suero bovino fetal (SBF); sin embargo, su uso presenta problemas por la variabilidad entre lotes y preocupaciones éticas derivadas de su obtención. Actualmente existen sustitutos al suero animal como son los derivados de las plaquetas, que poseen componentes bioactivos derivados principalmente de sus gránulos α, incluidas varias quimiocinas, factores reguladores, moléculas de adhesión y factores de crecimiento fundamentales para la nutrición y supervivencia celular. En el cultivo de células endoteliales (CE) se utilizan medios convencionales y medios comerciales (especializados) que difieren fundamentalmente en la composición de los suplementos de crecimiento, factores de crecimiento, hormonas, cofactores y componentes bioquímicos. El objetivo de este trabajo fue desarrollar y evaluar un sistema optimizado de cultivo y expansión de células endoteliales de la vena umbilical (HUVEC) a partir de derivados plaquetarios y comparar su rendimiento con un medio de cultivo comercial para el aislamiento y mantenimiento de células endoteliales de la vena de cordón umbilical humano. Metodología: Previa firma del consentimiento informado se tomaron los cordones umbilicales y se aislaron las HUVEC. Las células obtenidas se caracterizaron por citometría de flujo con los marcadores CD31, CD144, CD146, CD34 y HLA-DR. Se comparó el rendimiento del medio de crecimiento para células endoteliales ECGM-Promocell® con los medios desarrollados a partir de lisado plaquetario (LP) y suero de LP (SLP); se evaluó la adherencia, morfología y proliferación celular con los diferentes medios. Se implementó un sustrato proteico a partir de LP para recubrir los platos de cultivo. Resultados: Se desarrolló un sustrato proteico a partir de LP, se agregó a la superficie de los platos de cultivo, simulando una matriz extracelular para mejorar la adherencia celular, interacción célula – célula y célula – matriz, permitiendo una mayor proliferación y obtención de células endoteliales en comparación con los cultivos sin este sustrato proteico. Se obtuvo un medio de cultivo mixto a partir de la combinación de SLP y el medio ECGM-Promocell® (1:1 DMEM/hams F12: ECGM-Promocell®, 9 % de SLP, 2 ug/mL hidrocortisona), capaz de mantener la viabilidad, la adhesión y proliferación celular de las CEs por más de 10 pases sin afectar el fenotipo y morfología celular. Las células cultivadas con ECGM-Promocell® y, con el medio mixto, expresaron los marcadores de superficie CD31, CD144 y CD146 y fueron negativas para los marcadores CD34 y HLA-DR, comprobando el perfil de las células endoteliales. Conclusiones: Los derivados de plaquetas humanas contienen altas concentraciones de componentes bioactivos y posibilitan su uso como un suplemento para el cultivo, proliferación, mantenimiento y caracterización de diferentes tipos celulares. Con el medio de cultivo mixto y el medio comercial ECGM-Promocell®, se mantiene el fenotipo y morfología de las CEs. Además, con el desarrollo del sustrato proteico a partir del LP, se mejora la adherencia, se mantiene la viabilidad celular y se obtiene mayor cantidad de CEs. La suma del medio mixto y el sustrato proteico constituyen un sistema optimizado, de bajo costo y mayor eficiencia para el cultivo y expansión de HUVEC.

ABSTRACT: Culture media must supply the nutrients and essential conditions for cell metabolism, maintenance, and proliferation. Basal media are frequently supplemented with sera of animal origin, mainly fetal bovine serum (FBS); However, its use presents problems due to the variability between batches and ethical concerns derived from its obtaining. Currently, there are substitutes for animal serum such as those derived from platelets, which have bioactive components derived mainly from their α granules, including several chemokines, regulatory factors, adhesion molecules and growth factors fundamental for nutrition and cell survival. Endothelial cell (EC) culture uses conventional media and commercial (specialized) media that differ fundamentally in the composition of growth supplements, growth factors, hormones, cofactors, and biochemical components. The objective of this work was to develop and evaluate an optimized system based on platelet derivatives and compare its performance with a commercial culture medium for the isolation and maintenance of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Methodology: After signing the informed consent, the umbilical cords were taken and the HUVEC was isolated from them. The cells obtained were characterized by flow cytometry with the CD31, CD144, CD146, CD34 and HLA-DR markers. The performance of the basal medium ECGM-Promocell® for EC was compared with the media developed from platelet lysate (PL) and PL serum (PLS); the adherence, morphology and cell proliferation with the different media were evaluated. A protein substrate from PL was implemented to coat the culture dishes. Results: A protein substrate was developed from PL, added to the surface of culture dishes, simulating an extracellular matrix to improve cell adhesion, cell-cell and cell-matrix interaction, allowing greater proliferation and obtaining endothelial cells compared to cultures without this protein substrate. A mixed culture medium was obtained from the combination of PLS and the basal medium ECGM-Promocell® (1:1 DMEM-F12: ECGM-Promocell®, 9 % PLS, 2 ug/mL hydrocortisone), capable of maintaining the adhesion and cell proliferation of the ECs for more than 10 passes without affecting the phenotype and cell morphology. The cells cultured with ECGM-Promocell® and, with the mixed medium, expressed the surface markers CD31, CD144 and CD146 and were negative for the markers CD34 and HLA-DR, checking the profile of the endothelial cells. Conclusions: Human platelet derivatives contain high concentrations of bioactive components and enable their use as a supplement for the cultivation, proliferation, maintenance, and characterization of different cell types. With the mixed culture medium and the commercial basal medium ECGM-Promocell®, the phenotype and morphology of the ECs are maintained. In addition, with the development of the protein substrate from PL, adherence is improved, cell viability is maintained, and a greater number 15 of ECs is obtained. The sum of the mixed medium and the protein substrate constitute an optimized, low-cost, and highly efficient system for the cultivation and expansion of HUVEC.