A comprehensive study of potassium nutrition in Theobroma cacao L. : morphophysiological, biochemical, and genetic insights

Abstract

ABSTRACT: Climate change is causing global crop yield losses, emphasizing the need for new solutions to ensure food security in suboptimal environments. One potential approach is developing genotypes tolerant to potassium (K) nutrient deficiency for agriculturally important crops. However, limited progress has been made in developing genotypes with high potassium use efficiency (KUE). This is likely due to the complexity of the adaptation mechanisms that plants use to tolerate low K conditions, which are influenced by genotype-specific responses and environmental factors. For example, the characterization and development of K-efficient genotypes in cacao crops (T. cacao) remain almost unexplored. Given this scenario, our research used a multidisciplinary approach to understand the morphophysiological, biochemical, and molecular mechanisms underlying the response of T. cacao to different K regimes and identify potential genotypes with higher KUE. This also included developing transgenic tools to test the functionality of candidate genes for future breeding programs in T. cacao. First, we characterized seven T. cacao genotypes (FEAR5, IMC67, CAU39, FSV85, FSV89, CCN51, and FSV41) for their ability to grow under different K concentrations (0, 0.04, 0.4, and 4 mM). We correlated multiple parameters related to biomass and macronutrient distribution as well as photosynthetic performance. Based on high root proliferation, leaf biomass accumulation, maintenance of leaf N accumulation, and proper functioning of photosynthetic processes, we identified two potential contrasting T. cacao genotypes: FEAR5 (tolerant) and IMC67 (sensitive) to low K. Next, we explored their morphophysiological, biochemical, and molecular responses to sufficient (4 mM) and deficient (0 mM) K conditions to understand the adaptation mechanisms in these genotypes under K deficiency. Our results show that FEAR5 is more tolerant to K deficiency compared to IMC67, as evidenced by its superior growth and better photosynthetic activity. Additionally, the enzymatic activities of antioxidant enzymes (CAT, GR and APX) and carbon-related respiratory enzymes (G6PDH, NAD-GAPDH, MDH, ICDH, PK, PEPase) suggest higher sensitivity of IMC67 to altered cellular oxidative environments and carbon flow for primary metabolism. Finally, an RNA-seq analysis was conducted in the roots of FEAR5 and IMC67 genotypes, grown under both K conditions. We identified 1009 differentially expressed genes (DEGs), with 341 and 136 up-regulated and 503 and 109 down-regulated in FEAR5 and IMC67, respectively. The DEGs included diverse gene families such as ion transporters, C/N enzymes, hormones, signaling pathways, and transcription factors, which play a pivotal role in the adaptation of T. cacao to K deficiency, particularly in contributing to higher KUE in the tolerant genotype (FEAR5). These findings also reveal potential candidate genes for use in T. cacao breeding programs to improve KUE. Finally, we aimed to develop transgenic tools for the functional characterization of target genes through an Agrobacterium-mediated transformation process in somatic embryos of T. cacao. Testing the effect of different parameters, the results demonstrate a positive effect of sonication and the activation medium on the transient transformation rate, achieving up to 70-80%. The best results were obtained with the pGH00.0126 vector and the cotyledon segments of embryos in intermediate and late cotyledon stages. However, stable expression was much lower, between 1 and 2 %. Thus, we provide an effective protocol for conducting transient expression studies and functional characterization of target genes in embryogenic somatic tissues. This also encourages further optimization of the transformation process, particularly to increase the stable expression of agronomically important traits in regenerated transgenic cacao plants.

RESUMEN: El cambio climático está causando pérdidas en los rendimientos globales de los cultivos, lo que subraya la necesidad de nuevas soluciones para garantizar la seguridad alimentaria en entornos subóptimos. Un enfoque potencial es el desarrollo de genotipos tolerantes a la deficiencia del nutriente potasio (K) para cultivos importantes desde el punto de vista agrícola. Sin embargo, se ha avanzado poco en el desarrollo de genotipos con alta eficiencia en el uso del potasio (KUE). Esto se debe probablemente a la complejidad de los mecanismos de adaptación que las plantas utilizan para tolerar condiciones de bajo K, los cuales están influenciados por respuestas específicas de genotipo y factores ambientales. Por ejemplo, la caracterización y desarrollo de genotipos eficientes en K en cultivos de cacao (T. cacao) siguen siendo casi inexplorados. Considerenado este escenario, nuestra investigación utilizó un enfoque multidisciplinario para comprender los mecanismos morfofisiológicos, bioquímicos y moleculares que subyacen a la respuesta de T. cacao a diferentes regímenes de K y para identificar posibles genotipos con mayor KUE. Esto también incluyó el desarrollo de herramientas transgénicas para probar la funcionalidad de genes candidatos para futuros programas de mejoramiento en T. cacao. Primero, caracterizamos siete genotipos de T. cacao (FEAR5, IMC67, CAU39, FSV85, FSV89, CCN51 y FSV41) por su capacidad para crecer bajo diferentes concentraciones de K (0, 0.04, 0.4 y 4 mM). Correlacionamos múltiples parámetros relacionados con la biomasa y la distribución de macronutrientes, así como el rendimiento fotosintético. Basándonos en la alta proliferación de raíces, la acumulación de biomasa foliar, el mantenimiento de la acumulación de N en las hojas y el funcionamiento adecuado de los procesos fotosintéticos, identificamos dos genotipos potenciales contrastantes de T. cacao: FEAR5 (tolerante) e IMC67 (sensible) a bajo K. Luego, exploramos sus respuestas morfofisiológicas, bioquímicas y moleculares a condiciones de K suficiente (4 mM) y deficiente (0 mM) para comprender los mecanismos de adaptación en estos genotipos bajo deficiencia de K. Nuestros resultados muestran que FEAR5 es más tolerante a la deficiencia de K en comparación con IMC67, como lo evidencia su superior crecimiento y mejor actividad fotosintética. Además, las actividades enzimáticas de las enzimas antioxidantes (CAT, GR y APX) y las enzimas respiratorias relacionadas con el carbono (G6PDH, NAD-GAPDH, MDH, ICDH, PK, PEPasa) sugieren una mayor sensibilidad de IMC67 a los ambientes oxidativos celulares alterados y al flujo de carbono para el metabolismo primario. Finalmente, se realizó un análisis de secuenciación de ARN en las raíces de los genotipos FEAR5 e IMC67, cultivados bajo ambas condiciones de K. Identificamos 1009 genes expresados diferencialmente (DEGs), con 341 y 136 sobre-regulados y 503 y 109 bajo-regulados en FEAR5 e IMC67, respectivamente. Los DEGs incluyeron diversas familias de genes como transportadores de iones, enzimas C/N, hormonas, vías de señalización y factores de transcripción, que juegan un papel fundamental en la adaptación de T. cacao a la deficiencia de K, particularmente en contribuir a una mayor KUE en el genotipo tolerante (FEAR5). Estos hallazgos también revelan genes candidatos potenciales para su uso en programas de mejoramiento de T. cacao para mejorar la KUE. Finalmente, nuestro objetivo fue desarrollar herramientas transgénicas para la caracterización funcional de genes objetivo a través de un proceso de transformación mediada por Agrobacterium en embriones somáticos de T. cacao. Probando el efecto de diferentes parámetros, los resultados demuestran un efecto positivo de la sonicación y el medio de activación en la tasa de transformación transitoria, alcanzando hasta un 70-80%. Los mejores resultados se obtuvieron con el vector pGH00.0126 y los segmentos de cotiledón de embriones en etapas de cotiledón intermedias y tardías. Sin embargo, la expresión estable fue mucho menor, entre el 1 y el 2 %. Así, proporcionamos un protocolo efectivo para realizar estudios de expresión transitoria y caracterización funcional de genes objetivo en tejidos somáticos embriogénicos. Esto también fomenta la optimización adicional del proceso de transformación, particularmente para aumentar la expresión estable de rasgos agronómicamente importantes en plantas de cacao transgénicas regeneradas.