La inhibición génica y farmacológica del LRRK2 modulan el estrés oxidativo, la autofagia y la apoptosis en modelos celulares de la enfermedad de Parkinson: implicaciones terapéuticas

Abstract

RESUMEN: La enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno neurodegenerativo progresivo más común en el mundo. Este trastorno neurológico se caracteriza por alteraciones del movimiento, daño oxidativo y pérdida de neuronas dopaminérgicas (DAérgicas) en la región de la substancia negra parte compacta. La EP se ha asociado a mutaciones o factores de riesgo asociado a los genes de PARK1 al 19 de los pacientes con la EP. Dentro de estos genes se encuentra el gen PARK8 que codifica para le proteína quinasa rica en repeticiones de leucina 2 (LRRK2, por sus siglas en inglés) la cual se ha relacionado con la vulnerabilidad neuronal dopaminérgica al estrés oxidativo (EO), el deterioro mitocondrial y el aumento de la muerte celular en la enfermedad de Parkinson (EP) idiopática y familiar. Sin embargo, aún se desconoce cómo participa exactamente esta quinasa en la conexión EO--mitocondria-apoptosis. Además, se carece de un modelo in vitro que permita recapitular estos eventos moleculares. De modo que, durante los últimos años, la investigación de la EP se ha centrado no solo en el esclarecimiento los mecanismos moleculares involucrados en la relación entre LRRK2 y el EO sino también, en el desarrollo de modelos que sirvan de plataforma para la búsqueda de alternativas terapéuticas. El objetivo de nuestro estudio fue desarrollar modelos in vitro con el fin de investigar el efecto de la inhibición genética y farmacológica de LRRK2 y su relación con los mecanismos de EO, muerte celular y autofagia. Adicionalmente, nos interesamos en evaluar el potencial antioxidante y neuroprotector de extractos de Persea americana (P. americana) en los modelos in vitro expuestos al EO. Inicialmente utilizamos la repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas CRISPR/Cas9 para eliminar el gen LRRK2 ( LRRK2 knockout KO) en la línea celular de riñón embrionario humano 293 (HEK-293) y evaluar la respuesta celular al inhibidor mitocondrial complejo I rotenona (ROT), un conocido inductor de OS y muerte celular, en términos de las especies reactivas de oxígeno intracelular (ROS, DJ-1-Cys106-SO3 oxidado); fosforilación de LRRK2 y c-JUN, expresión de la proteína tumoral del modulador de la apoptosis regulado por p53 (PUMA, y de Parkina (PRKN); activación de la caspasa 3 (CC3), fragmentación del ADN y disminución del potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm) y de la quinasa putativa 1 inducida por PTEN (PINK), y DRP1 en comparación con las células WT tratadas y no tratadas con ROT. Estos mismos marcadores fueron analizados en células semejantes a neuronas (CSNs) obtenidas de células mesenquimales estromales de Cordón umbilical (CME-CU) expuestos a PQ+MB en presencia o ausencia del inhibidor de LRRK2 PF- 06447475 (PF-475) y extracto rico en fenoles de cáscara de aguacate Persea americana var. Colinred (CRE). Finalmente se analizaron marcadores neuropatológicos de la EP (p-αSyn) de mitocondria (∆Ψm, Parkina, DRP1), muerte celular (CC3), y autofagia (LC3-II), fosforilación de LRRK2 (p-LRRK2) en Neuronas dopaminergicas (NDAs) derivadas de células mesenquimales estromales de Sangre menstrual (CME-SM). El análisis de los marcadores neuropatológicos en las células HEK293, mostró una reducción significativa en los marcadores asociados a la muerte celular y el estrés oxidativo en células HEK293 LRRK2 KO con respecto a las HEK29 WT. Este mismo comportamiento se observó en las CSNs tratadas con el inhibidor de LRRK2 PF- 06447475 (PF-475) y el CRE bajo el estímulo de EO inducido por PQ y MB. Mas interesante aún el inhibidor PF-475 en las NDAs intoxicadas con ROT de manera crónica y aguda logró revertir los marcadores neuropatológicos y la alteración de los marcadores lisosomales cuyo aumento se evidenció en la intoxicación crónica. En conjunto, nuestros datos sugieren que la quinasa LRRK2 regula tanto la muerte celular apoptótica como la autofagia en diferentes modelos in vitro evaluados bajo EO. Así mismo, los extractos metanólicos de P. americana tienen un mecanismo antiapoptótico asociado a su capacidad antioxidante. Dado que los defectos en la actividad del complejo mitocondrial I son comúnmente observados en la EP, el PQ+MB y la ROT funciona bien como un modelo químico de la EP tanto en condiciones agudas como crónicas. Así mismo estos hallazgos validan los modelos neuronales desarrollados como herramientas para la búsqueda de alternativas terapéuticas en la EP, las cuales de acuerdo con nuestros resultados deben estar enfocados en la inhibición de la quinasa LRRK2 y el uso de moléculas con actividad antioxidantes.

ABSTRACT: Parkinson's disease (PD) is the second most common progressive neurodegenerative disorder in the world. This neurological disorder is characterized by movement disorders, oxidative damage and loss of dopaminergic (DAergic) neurons in the substantia nigra pars compacta region. PD has been associated with mutations or risk factors associated with PARK1-21 genes in.PD patients. Among these genes is the PARK8 gene encoding for leucine repeat-rich protein kinase 2 (LRRK2) which has been linked to dopaminergic neuronal vulnerability to oxidative stress (OS), mitochondrial impairment and increased cell death in idiopathic and familial Parkinson's disease (PD). However, exactly how this kinase participates in the EO--mitochondria--apoptosis connection is still unknown. Moreover, an in vitro model to recapitulate these molecular events is lacking. Thus, during the last few years, PD research has focused not only on elucidating the molecular mechanisms involved in the relationship between LRRK2 and EO, but also on the development of models that serve as a platform for the search for therapeutic alternatives. The aim of our study was to develop in vitro models in order to investigate the effect of genetic and pharmacological inhibition of LRRK2 on the mechanisms of EO, cell death and autophagy. Additionally, we were interested in evaluating the antioxidant and neuroprotective potential of Persea americana (P. americana) extracts in in vitro models exposed to EO. First we used the clustered regularly interspaced short palindromic repeats CRISPR/Cas9 to knock out the LRRK2 gene ( LRRK2 knockout KO) in the human embryonic kidney cell line 293 (HEK-293) and evaluate the cellular response to the mitochondrial inhibitor complex I rotenone (ROT), a known inducer of OS and cell death, in terms of intracellular reactive oxygen species (ROS, oxidized DJ-1-Cys106-SO3); LRRK2 and c-JUN phosphorylation, tumor protein expression of p53-regulated modulator of apoptosis (PUMA, and Parkin (PRKN); activation of caspase 3 (CC3), DNA fragmentation and decreased mitochondrial membrane potential (∆Ψm) and PTEN-induced putative kinase 1 (PINK), and DRP1 compared to ROT-treated and untreated WT cells. These same markers were analyzed in neuron-like cells (NSCs) obtained from umbilical cord mesenchymal stromal cells (UC-MSCs) exposed to PQ+MB in the presence or absence of the LRRK2 inhibitor PF- 06447475 (PF-475) and phenol-rich extract of avocado peel Persea americana var. Colinred (CRE). Finally, neuropathological markers of PD (p-αSyn) of mitochondria (∆Ψm, Parkin, DRP1), cell death (CC3), and autophagy (LC3-II), phosphorylation of LRRK2 (p-LRRK2) were analyzed in menstrual blood stromal mesenchymal stromal cell (MB-MSCs)-derived dopaminergic neurons (DALNs). Analysis of neuropathological markers in HEK293 cells showed a significant reduction in markers associated with cell death and oxidative stress in HEK293 LRRK2 KO cells with respect to HEK29 WT cells. This same behavior was observed in CSNs treated with the LRRK2 inhibitor PF- 06447475 (PF-475) and CRE under PQ- and MB-induced EO stimulus. More interestingly, PF-475 inhibitor in chronically and acutely ROT intoxicated DALNs was able to reverse neuropathological markers and alteration of lysosomal markers whose increase was evidenced in chronic intoxication. Taken together, our data suggest that LRRK2 kinase regulates both apoptotic cell death and autophagy in different in vitro models evaluated under EO. Likewise, methanolic extracts of P. americana have an anti-apoptotic mechanism associated with their antioxidant capacity. Since defects in mitochondrial complex I activity are commonly observed in PD, PQ+MB and ROT function well as a chemical model of PD in both acute and chronic conditions. Likewise, these findings validate the neuronal models developed as tools for the search of therapeutic alternatives in PD, which according to our results should be focused on the inhibition of LRRK2 kinase and the use of molecules with antioxidant capacity.