Estandarización de técnicas de inmunohistoquímica para evaluar neuroplasticidad en el hipocampo de la especie porcina

Abstract

RESUMEN: El sistema nervioso (SN) posee plasticidad que le permite adaptarse a cambios fisiológicos y patológicos. La neurogénesis es una forma de neuroplasticidad (NP) y es el proceso de generación de nuevas neuronas en el SN de los mamíferos. Esta tiene efectos sobre la memoria, la regulación emocional, el aprendizaje, la respuesta al estrés y la adaptación al ambiente. La producción intensiva de cerdos produce estrés crónico en estos animales. El estrés tiene efectos deletéreos sobre los sistemas orgánicos y es un factor extrínseco que regula de forma negativa la neurogénesis. El estrés crónico es un problema con múltiples implicaciones en el sector porcícola, pero la comprensión de los mecanismos involucrados en la neurogénesis ha sido poco estudiada en esta especie, en parte debido a la escases de métodos de estudio estandarizados y documentados sistemáticamente para su uso por la comunidad científica. Por lo anterior y considerando que, en el desarrollo de futuros programas de tratamiento para reducir el estrés en porcinos, mejorar su salud y su bienestar, será necesario evaluar el efecto de dichos desarrollos sobre la neurogénesis. Esta investigación se realizó con el objetivo de estandarizar técnicas inmunohistoquímicas para evaluar neuroplasticidad en el hipocampo (HC) de la especie porcina. Para la estandarización de las técnicas se incluyeron 6 lechones cruce comercial (C29 x PIC 410), seleccionados de forma aleatoria. Se hicieron necropsias dirigidas al SNC, se obtuvo el cerebro y se realizó su disección hasta obtener el hipocampo. Los hipocampos izquierdos se fijaron en formol al 4% y fueron sometidos a procesamiento histológico. Los hipocampos derechos fueron fijados en paraformaldehído (PFA) al 4% por un método de inmersión para inmunoensayo (complejo avidina-biotina (ABC) con AC anti-Neun Mouse EPR12763 marcador ab177487, 1:500 con Ac secundario rabbit biotinilado 1:250) e inmunofluorescencia (Ki67 1:500 marcado con Fluoróforos rojo Alexa 545 1:700 y Neun 1:500 marcado con Fluoróforos Verde Alexa 488 1:700). Como resultado, normalizamos del protocolo de necropsia dirigida al SNC, optimizando el tiempo de craneotomía de 20 a 6 minutos. Se estandarizó un protocolo de fijación por inmersión en cerdos demostrando su viabilidad para el procesamiento preanalítico de HC, garantizando una adecuada inmunomarcación. Además, nuestros resultados muestran inmunoreactividad de los anticuerpos seleccionados para la especie porcina. Esta investigación permitió el desarrollo de un manual de procedimientos que pondrá a disposición una herramienta para la evaluación de la neuroplasticidad con un valor traslacional a otras especies. Se creó un neurobanco para almacenar tejidos y continuar con la estandarización de otras técnicas y estamos aplicando estos protocolos en investigaciones del grupo Quirón.

ABSTRACT: The nervous system (NS) possesses plasticity that allows it to adapt to physiological and pathological changes. Neurogenesis is a form of neuroplasticity (NP) and is the process of generation of new neurons in the SN mammalian. It effects memory, emotional regulation, learning, stress response, and adaptation to the environment. Intensive pig production produces chronic stress in these animals. Stress has deleterious effects on organ systems and is an extrinsic factor that negatively regulates neurogenesis. Chronic stress is a problem with multiple implications in the swine industry, but an understanding of the mechanisms involved in neurogenesis has been studied little in this species, partly due to the scarcity of standardized and systematically documented study methods for use in the scientific community. Therefore, and considering that in the development of future treatment programs to reduce stress with pigs, improve their health and welfare, it will be necessary to evaluate the effect of these developments on neurogenesis. This research was developed with the main objective of standardizing immunohistochemical techniques to evaluate neuroplasticity in the hippocampus (HC) of the porcine species. 6 commercial crossbred piglets (C29 x PIC 410), randomly selected, were included for the standardization of these techniques. Necropsies were performed directed to the CNS. The brain was dissected until the hippocampus was obtained. The left hippocampi were fixed in 4% formalin and subjected to histological processing. The right hippocampi were fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) by an immunoassay immersion method (avidin-biotin complex (ABC) with AC anti-Neun Mouse EPR12763 marker ab177487, 1: 500 with biotinylated rabbit secondary Ac 1:250) and immunofluorescence (Ki67 1:500 labeled with Alexa Fluorophore Red 545 1:700 and Neun 1:500 labeled with Alexa Fluorophore Green 488 1:700). As a result, we standardized the necropsy protocol directed to the CNS, optimizing the craniotomy time from 20 minutes to 6. An immersion fixation protocol was standardized in pigs demonstrating its feasibility for the pre-analytical processing of HC, guaranteeing an adequate immunolabeling. Furthermore, our results show immunoreactivity of the selected antibodies for the porcine species. This research allowed the development of a procedures manual that will provide a tool for the evaluation of neuroplasticity with a translational value to other species. A neurobank was created to store tissues and continue with the standardization of other techniques. We are applying these protocols in research with the Quirón group.