Estandarización de técnicas de inmunohistoquímica para evaluar neuroplasticidad entérica en porcinos

Abstract

RESUMEN: El sistema de producción porcícola intensivo actual a nivel mundial, expone a los animales a diversos estresores (sociales, ambientales, inmunológicos, metabólicos y por manejo) con consecuencias que se manifiestan en respuestas fisiológicas y comportamentales alteradas, reflejándose en diferentes sistemas orgánicos, uno de ellos, frecuentemente afectado en los cerdos es el sistema gastrointestinal. Esta investigación se focaliza en este sistema orgánico, debido a que aloja al Sistema Nervioso Entérico (SNE), el cual incluye circuitos neuronales que controlan las funciones motoras, el flujo sanguíneo local, el transporte a través de mucosas, las secreciones, y modula funciones inmunológicas. Dicha red neuronal puede experimentar cambios estructurales y funcionales en respuesta a estímulos tanto instrínsecos como extrínsecos. Como grupo de investigación nos hemos planteado evaluar los cambios neuroplásticos del SNE, sin embargo, la literatura disponible para la especie es limitada y no da cuenta de protocolos precisos que permitan evaluar los componentes del SNE. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue estandarizar técnicas de inmunohistoquímica que permitieran evaluar los componentes del SNE en el íleon de la especie porcina. El proceso de estandarización incluyó la optimización en las condiciones de obtención, fijación y preparación de los tejidos, así como la evaluación de los componentes del sistema nervioso entérico. Se utilizaron muestras de intestinos (específicamente la porción del íleon) de ocho porcinos cruce comercial (C29 x PIC 410) entre los 30 y 35 días de nacidos. Los componentes del SNE se evaluaron mediante varias técnicas, incluyendo histoquímica para los tejidos procesados con la técnica de preparado de membrana, así como con la técnica de inmunofluorescencia estandarizando un marcador específico de neuronas maduras anti-NeuN (1:500 EPR12763 Abcam, Australia) y un marcador de proliferación celular Ki67 (1:500 16667 Abcam, Australia). La evaluación de los protocolos se realizó a través de un análisis cualitativo de las secciones, centrándose en la especificidad y sensibilidad de los marcadores seleccionados. Los resultados demostraron que la metodología usada para la obtención de las muestras garantizó una buena calidad del tejido, lo que se traduce en la posibilidad de aplicar los métodos histoquímicos e inmunohistoquímicos. Por otra parte, el protocolo estandarizado para la técnica de inmunofluorescencia es eficaz para visualizar algunos componentes del SNE en el íleon de porcinos con la expresión positiva de un marcador neuronal específico. La exploración del tejido con la técnica de preparado de membrana y coloración de Azul de Toluidina, permitió exponer y visualizar los cuerpos neuronales presentes en el plexo mientérico. Como producto de está estandarización, se desarrolló un manual de procedimientos que contiene toda la información transversal al procesamiento y análisis de muestras obtenidas del sistema digestivo porcino para la evaluación del SNE en la especie. El cual proporciona una noción metodológica para la evaluación del SNE en porcinos y pone a disposición una guía de procedimientos que pueden facilitar el abordaje del SNE en porcinos desde la etapa preanalítica hasta su análisis.

ABSTRACT: The current global intensive pig production system exposes animals to various stressors (social, environmental, immunological, metabolic, and management-related), resulting in altered physiological and behavioral responses. Chronic stress is widely recognized as a relevant cofactor in the onset of diseases. Its effects are reflected in different organ systems, one of which, frequently affected in pigs, is the gastrointestinal system. This research focuses on this organ system because it houses the Enteric Nervous System (ENS), which includes neural circuits that control motor functions, local blood flow, mucosal transport, secretions, and modulate immune functions. This neural network, like the neurons in the central nervous system, can experience changes in its structure and function, meaning it can modify its activity in response to both intrinsic and extrinsic stimuli. This series of changes corresponds to the phenomenon of neuroplasticity, which encompasses the concept of neurogenesis, referring to the birth, proliferation, and maturation of new neurons. The objective of this study was to standardize immunohistochemical techniques to evaluate neuroplasticity in the ileum of pigs, due to the limited information currently available for the assessment of the ENS in this species. The standardization process included the optimization of conditions for tissue collection, fixation, and preparation, as well as the evaluation of the components of the enteric nervous system. Intestinal samples (specifically from the ileum) were obtained from eight commercial crossbred pigs (C29 x PIC 410) between 30 and 35 days of age. The components of the ENS were evaluated using a histochemical technique with special Toluidine Blue staining on tissues processed with a membrane preparation technique, as well as immunofluorescence, standardizing a specific marker for mature neurons (anti-NeuN, 1:500 EPR12763 Abcam, Australia) and a cell proliferation marker (Ki67, 1:500 16667 Abcam, Australia). The evaluation of the protocols was performed through a qualitative analysis of the sections, focusing on the specificity and sensitivity of the selected markers. The results demonstrated that the methodology used for sample collection ensured good tissue quality, allowing for the application of histochemical and immunohistochemical methods. Furthermore, the standardized protocol for the immunofluorescence technique proved effective in visualizing certain components of the ENS in the ileum of pigs, with positive expression of a specific neuronal marker. Examination of the tissue using the membrane preparation technique and Toluidine Blue staining enabled the exposure and visualization of neuronal cell bodies present in the myenteric plexus. As a product of this standardization, a procedures manual was developed containing comprehensive information on the processing and analysis of samples obtained from the porcine digestive system for the evaluation of the ENS in this species. This manual provides a methodological framework for the assessment of the ENS in pigs and offers a guide to procedures that can facilitate the approach to the ENS from the pre-analytical stage to analysis.