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Título : Actividad antiviral In vitro e interacciones In silico de alcaloides indólicos aislados de Tabernaemontana cymosa frente a la infección por los virus Zika, Chikungunya y Dengue
Autor : Monsalve Escudero, Laura Milena
metadata.dc.contributor.advisor: Martínez Gutiérrez, Marlen
metadata.dc.subject.*: Antivirales
Antiviral agents
Alcaloides
Alkaloids
Tabernaemontana
Dengue
Virus Zika
Zika Virus
Virus Chikungunya
Chikungunya virus
Fecha de publicación : 2019
Resumen : RESUMEN: Introducción: Los virus Zika (ZIKV), Chikungunya (CHIKV) y Dengue (DENV) son agentes virales trasmitidos por mosquitos del género Aedes. El tratamiento disponible para estas virosis es inespecífico, por lo que la búsqueda de compuestos antivirales de origen natural ha cobrado importancia en los últimos años. Objetivo general: Evaluar la actividad in vitro e interacciones in silico de tres alcaloides indólicos aislados de T. cymosa frente la infección por ZIKV, CHIKV y DENV. Metodología: Las infecciones se realizaron con cepas de referencia de DENV-2/NG y DENV-2/16681 y aislados clínicos de ZIKV-Acol y CHIKV-Acol. La toxicidad de cada compuesto se evaluó mediante el método MTT en VERO (desde 8,1 μM hasta 271,4 μM); en células U397 y A459 se evaluó la concentración de uso para Voacangina de 17,1 μM y para Voacangina-OH y Rupicolina de 16,4 uM. Se determinó el potencial antiviral de los alcaloides indólicos mediante estrategia antiviral combinada y se hicieron diferentes estrategias experimentales para identificar el posible paso del ciclo replicativo que está siendo afectado (Pre-tratamiento, Trans-tratamiento y Post-tratamiento). Las partículas virales infecciosas se determinaron por titulación en placa, las copias genómicas se cuantificaron por PCR en tiempo real y la cuantificación de proteína viral se realizó por Cell-ELISA. Se hizo acoplamiento molecular para evaluar la interacción con una proteína estructural (Envoltura) y otra proteína no estructural (NS5 para ZIKV, DENV y NSP2 para CHIKV). Resultados: los compuestos tuvieron baja toxicidad a concentraciones menores de 16,4 μM para Voacangina-OH y Rupicolina, y a 17,1 μM para Voacangina en VERO, U937 y A549. Los alcaloides indólicos evaluados demostraron un potencial antiviral contra DENV-2/NG, DENV-2/16681, ZIKV y CHIKV al ser capaz de inhibir las partículas virales infecciosas mediante estrategia antiviral combinada con porcentajes de inhibición superiores a 79,7%. Voacangina inhibió pasos iniciales del ciclo repliactivo de CHIKV en la línea celular VERO en un 76,8%, tuvo un posible efecto virucida frente a la cepa DENV-2/NG en la misma línea celular al inhibir partícula viral infecciosa en un 88,7% y además inhibió la infección de ZIKV en pasos previos a la replicación viral en un 86,2%, 100% y 84,8% en VERO, U937 y A549 respectivamente, y en pasos posteriores a la replicación viral en un 80,8% en VERO y en un 100% para U937 y A549, disminuyendo a su vez la síntesis de proteína en las tres líneas celulares evaluadas. Voacangina-OH disminuyó la infección de CHIKV y DENV-2/NG en un 89% y 83,5% en Pre-tratamiento, respectivamente. Además, inhibió partículas virales infecciosas de ZIKV en VERO en un 89% en Pre-tratamiento, 92,4% en Trans-tratamiento y 88,4% Post-tratamiento, adicionalmente disminuyó la infección en Pre-tratamiento en un 100% en U937 y en un 98,2% en A549, y en un 100% en Post-tratamiento en U937 y A549. Voacangina-OH fue capaz de disminuir la síntesis de proteína de ZIKV en las tres líneas celulares evaluadas. Por su parte, Rupicolina fue capaz de inhibir en post-tratamiento a CHIKV en células VERO en un 90,9% sin afectar la síntesis de proteína y a DENV-2/NG en etapas iniciales del ciclo replicativo en VERO 70,4% y en A549 en un 60%. In silico, la proteína E de ZIKV, CHIKV y de DENV interactuó con Voacangina, Voacangina-OH y Rupicolina con energías de unión entre -5,1 y -6,9 Kcal/mol. Con la proteína NS5 de ZIKV y DENV y NSP2 de CHIKV con energías de unión entre -6,4 y -7,4 Kcal/mol. El mejor complejo de interacción de la proteína E de DENV y Voacangina fue estable durante 10 ns de simulación en NAMD. Conclusión: Los resultados in vitro obtenidos han demostrado que la Voacangina, la Voacangina-OH y la Rupicolina son antivirales promisorios contra la infección por ZIKV, CHIKV y DENV-2, destacando el efecto antiviral de Voacangina-OH frente a la infección por ZIKV en múltiples pasos del ciclo replicativo e independiente de línea celular.
ABSTRACT. Introduction: Zika (ZIKV), Chikungunya (CHIKV) and Dengue (DENV) viruses are viral agents transmitted by Aedes mosquitoes. The treatment available for these virosis is nonspecific, so the search for naturally occurring antiviral compounds has gained importance in recent years. General aim: To evaluate the in vitro activity and in silico interactions of three isolated indolic alkaloids from T. cymosa against ZIKV, CHIKV and DENV infection. Methodology: Infections were performed with reference strains of DENV-2 / NG and DENV-2/16681 and clinical insolation of ZIKV-Acol and CHIKV-Acol. The toxicity of each compound was evaluated by the MTT method in VERO (from 8.1 μM to 271.4 μM); in U397 and A459 the use concentration for Voacangina of 17.1 μM and for Voacangina-OH and Rupicolina of 16.4 μM was evaluated. The antiviral potential of indole alkaloids was determined by combined antiviral strategy and different experimental strategies were made to identify the possible stages of the replicative cycle that is being affected (Pre-treatment, Trans-treatment and Post-treatment). Infectious viral particles were determined by plaque titration, genomic copies were quantified by real-time PCR and viral protein quantification was performed by Cell-ELISA. Molecular docking was made to evaluate the interaction with a structural protein (envelope) and another non-structural protein (NS5 for ZIKV and DENV and NSP2 for CHIKV). Results: the compounds had lower toxicity at concentrations less than 16.4 μM for Voacangina-OH and Rupicolina, and 17.1 μM for Voacangina on VERO, U937 and A549. The indole alkaloids evaluated demonstrated an antiviral potential against DENV-2 / NG, DENV-2/16681, ZIKV and CHIKV by being able to inhibit infectious viral particles by combined antiviral strategy with inhibition rates greater than 79.7%. Voacangin inhibited initial steps of the CHIKV replicative cycle in the VERO cell line by 76.8%; had a possible virucidal effect against the DENV-2 / NG strain in the same cell line by inhibiting infectious viral particle in 88.7%; It also inhibited ZIKV infection in steps prior to viral replication in 86.2%, 100% and 84.8% in VERO, U937 and A549 respectively, and in subsequent steps to viral replication in 80.8% in VERO and 100% for U937 and A549, in turn decreasing protein synthesis in the three cell lines evaluated. Voacangina-OH decreased the infection of CHIKV and DENV-2 / NG by 89% and 83.5% in Pre-treatment, respectively. In addition, it inhibited ZIKV infectious viral particle in VERO by 89% in Pre-treatment, 92.4% in Trans-treatment and 88.4% Post-treatment, additionally decreased infection in Pre-treatment by 100% in U937 and in 98.2% in A549, and in 100% in Post-treatment in U937 and A549. Voacangina-OH was able to decrease the synthesis of ZIKV protein in the three cell lines evaluated. For its part, Rupicolina was able to inhibit CHIKV in VERO cells by 90.9% in post-treatment without affecting protein synthesis and DENV-2 / NG in the early stages of the VERO 70.4% replicative cycle and in A549 by 60%. In silico protein E of ZIKV, CHIKV and DENV interacted with Voacangina, Voacangina-OH and Rupicolina with binding energies between -5.1 and -6.9 Kcal / mol. With the NS5 protein of ZIKV and DENV and NSP2 of CHIKV with binding energies between -6.4 and -7.4 Kcal / mol. The best interaction complex of DENV and Voacangin E protein was stable during 10 ns of simulation in NAMD. Conclusion: The in vitro results obtained have shown that Voacangina, Voacangina-OH and Rupicolina are promising antivirals against ZIKV, CHIKV and DENV-2 infection, highlighting the antiviral effect of Voacangina-OH against ZIKV infection in multiple steps of the replicative cycle and independent of cell line.
Aparece en las colecciones: Maestrías en Ciencias Básicas Biomédicas

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