Genotipificación y descripción de la variabilidad genética de Cryptosporidium spp., identificado en muestras de pacientes colombianos, utilizando análisis multilocus de secuencias

Abstract

RESUMEN: Los protistas del género Cryptosporidium, son parásitos con una distribución cosmopolita, favorecida por el amplio rango de hospedadores (animales y humanos) al que puede infectar, las diferentes rutas de transmisión y diversas fuentes de infección. Estos patógenos son prevalentes en humanos especialmente en población infantil e inmunocomprometida, en quienes puede causar alteraciones gastrointestinales que suelen cursar con diarreas osmóticas-secretoras persistentes, en algunos casos letales. En niños menores de cinco años las infecciones crónicas, además, pueden causar daños que alteran su desarrollo físico y cognitivo. En la actualidad se reportan 39 especies de Cryptosporidium, con diversidad o variabilidad genética dentro de las mismas, probablemente asociada con diferencias en patogenicidad, especificidad de hospedador y patrones de propagación en la naturaleza. La mayoría de los estudios para analizar la variabilidad génica de Cryptosporidium spp., se han basado en análisis unilocus, especialmente con el marcador gp60; sin embargo, este tipo de análisis y este marcador, presenta limitaciones para identificar variantes genéticas que permitan de una manera precisa hacer análisis de diversidad, estructura poblacional y dinámica de transmisión, asociados con eventos genéticos y evolutivos de este parásito; información que se explora con mayor resolución usando análisis multilocus de secuencia (MLST), dentro de los cuales se podrían incluir a gp60 como marcador. A la fecha, en Colombia no se conocen trabajos sobre la variabilidad genética de Cryptosporidium utilizando análisis MLST, datos útiles y necesarios para el estudio de la dinámica de transmisión de este parásito en nuestro país. En el presente estudio se identificaron las especies y subgenotipos de parásitos del género Cryptosporidium procedente de pacientes colombianos, mediante el análisis de secuencia de regiones parciales de los genes 18S rRNA y gp60 respectivamente. Además, se realizaron análisis de variabilidad génica usando análisis de múltiples loci, para los cuales fue necesario validar y evaluar el comportamiento individual de los marcadores seleccionados (CP47, gp60, ML2, MS5, MS9, MSC6-7 y TP14). Con la información de la secuencia obtenida de todos los marcadores por cada muestra incluida en el trabajo, se construyó una secuencia concatenada o consenso (SC) que se usó para realizar (i) análisis filogenéticos, (ii) establecer los genotipos multilocus (MLG), (iii) determinar los índices de diversidad génica: Hd, Pi, S, K y (iv) realizar comparaciones entre las poblaciones clínicas incluidas en el estudio, mediante el índice de fijación génica. Con base en la metodología anterior, se identificaron cinco especies en 28 individuos incluidos en el estudio, C. hominis (16/28), C. parvum (8/28), C. felis (2/28), C. meleagridis (1/28) y C. suis (1/28), reportándose por primera vez las especies C. meleagridis y C. felis infectando a humanos en Colombia. La subgenotipificación unilocus con base en gp60, evidenció cuatro familias alélicas para C. hominis (Ia, Ib, Id y Ie), con el subgenotipo IbA10G2 como el más frecuente. Para C. parvum, se identificaron dos familias alélicas, IIa y IIc, siendo más frecuente la IIa, y aunque la familia IIc sólo se identificó en una muestra, fue un dato importante toda vez que se asocia con transmisión antroponótica dentro de C. parvum. Adicionalmente se reportan tres subgenotipos nuevos, con base en análisis unilocus de gp60 (IaA13R6, IaA11R3 y IIaA19G5R1). Se presenta, bajo nuestro conocimiento el primer trabajo realizado en Colombia sobre variabilidad genética basado en análisis MLST en los que se incluyeron 22 muestras (C. hominis 14/22 y C. parvum 8/22). Como resultados de estos análisis se observó un comportamiento polimórfico de todos los marcadores tanto para C. hominis como para C. parvum, especialmente con CP47, MS5 y gp60, marcadores con los cuales incluso se evidenciaron alelos únicos en algunas muestras. Los análisis filogenéticos con las SC mostraron una concordancia taxonómica con los resultados obtenidos con base en 18S rRNA y gp60, y además permitieron evidenciar la formación dos grupos monofiléticos que agrupaban a las especies C. hominis y C. parvum, manteniéndose el comportamiento diferencial observado con gp60 y además aumentando el número de subcladas al interior de los grupos monofiléticos. 1 Los análisis MLST con las SC, permitieron la identificación en las muestras C. hominis de 13 genotipos multilocus (MLG) y ocho para las muestras C. parvum; además se observó diversidad haplotípica multilocus independiente y no influenciada por gp60, y variabilidad genética también independiente de este marcador, pero influida por el mismo. En las comparaciones intra-especie por poblaciones clínicas, se observó dentro de las muestras C. parvum, diferencias génicas entre las muestras de los pacientes VIH positivos y los niños de Santander, con evidencia de menor cercanía evolutiva entre los parásitos C. parvum de estas dos poblaciones. En conclusión, los datos obtenidos con este trabajo aportan evidencia científica de diversidad genética en los parásitos C. hominis y C. parvum identificados en muestras de pacientes VIH positivos y niños de Colombia, y soportan el evidente aporte y la necesidad del uso de análisis de múltiples loci, que permitan un abordaje más detallado y minucioso para los análisis de diversidad, que puedan explicar algunos eventos que gp60 como único marcador no permite; además, que son necesarios otros estudios a mayor escala, multicéntricos y multidisciplinarios para conocer la dinámica de transmisión y la estructura poblacional de Cryptosporidium spp. en Colombia. Palabras clave: Cryptosporidium, MLST, variabilidad genética, Colombia, epidemiología molecular.

ABSTRACT: Protists of the genus Cryptosporidium are cosmopolitan parasites with a wide range of vertebrate hosts (animals and humans) and multiple transmission routes and infection sources. These pathogens are prevalent in humans, especially in children and immunocompromised populations, and are associated with chronic watery diarrhea, which sometimes can be fatal. Impaired physical and cognitive development has also been reported in children under five years of age with chronic infections. Until now there are 39 recognized species within the Cryptosporidium genus, with a great intra-species genetic diversity, which is probably associated with differences with the pathogenesis, host specificity, and propagation patterns of this parasite. Most of the studies on genetic variability in Cryptosporidium are based on unilocus analysis, being the gp60 gene the most characterized marker. However, a major limitation of this approach is their inability to provide accurate data on genetic diversity, population structure, and transmission dynamics, which is associated with genetic and evolutionary events in this parasite. Multilocus Sequences Analysis (MLST) are acknowledged to improve resolution over the analysis of a single locus, giving useful information to study genetic variability. Unfortunately, in Colombia, so far, there are no reports on Cryptosporidium studies in human samples using MLST analysis. In the present study, Cryptosporidium species and subgenotypes circulating in Colombian patients were identified through the sequence analysis of partial regions of 18S rRNA and gp60 genes, respectively. Additionally, genetic variability was studied using an MLST strategy, after the evaluation and validation of the individual behavior of the selected markers (CP47, gp60, ML2, MS5, MS9, MSC6-7, and TP14). A concatenated/consensus sequence- SC was constructed with the sequence information obtained from all the markers for each sample, which was used to perform: (i) phylogenetic analysis, (ii) Multilocus genotypes (MLG) identification, (iii) genetic diversity indices (Hd, Pi, S, K) determination, and (iv) comparisons between the clinical populations included in the study through the gene fixation index. Based on the previous methodology, five species were identified in 28 individuals: C. hominis (16/28), C. parvum (8/28), C. felis (2/28), C. meleagridis (1/28) and C. suis (1/28). This is the first report of C. meleagridis and C. felis in humans in Colombia. Unilocus subgenotyping based on gp60 showed four allelic families for C. hominis (Ia, Ib, Id, and Ie), with the IbA10G2 subgenotype as the most frequent. For C. parvum, two allelic families were identified, IIa and IIc, with IIa as the most frequent. Although the IIc family was only identified in one sample, it is important to point out the relevance of this finding since it is associated with anthroponotic transmission within C. parvum. Additionally, three new subgenotypes are reported based on the unilocus analysis of gp60 (IaA13R6, IaA11R3 y IIaA19G5R1). To our knowledge, this is the first work on genetic variability based on MLST analysis in human samples in Colombia, which included 22 samples (C. hominis 14/22 and C. parvum 8/22). A polymorphic behavior was observed for both C. hominis and C. parvum, especially with CP47, MS5, and gp60 markers, for which even unique alleles were identified in some samples. Phylogenetic analysis with the SC showed an adequate taxonomic compared to the results obtained with 18S rRNA; and also, they allowed the identification of two monophyletic clades that separated the subgenotypes of the C. hominis and C. parvum related species. Additionally, thirteen and eight multilocus genotypes (MLG) were identified for C. hominis and C. parvum, respectively. High haplotypic diversity was observed with MLST analysis, which was independent and not influenced by gp60. Although genetic variability was also independent of this marker, it was influenced by this. The variability indices obtained were higher in C. hominis than in C. parvum; however, in the intra-species comparisons for clinical populations, genetic differences were observed between the C. parvum samples of the HIV positive patients and the children from Santander, with evidence of less evolutionary closeness between the C. parvum parasites of these two clinical populations. Keywords: Cryptosporidium, MLST, genetic variability, Colombia, molecular epidemiology.