Bone morphogenetic protein 2 : heterologous expression and potential in bone regeneration

Abstract

ABSTRACT: Currently, bone morphogenetic protein 2 (BMP‐2) is one of the two osteoinductive growth factors used in medical devices to promote bone formation. Typically, this protein is bought from commercial houses at high rates and in small quantities that are not enough to cover clinical needs. Because of this, it has been proposed that research centers use their own heterologous expression systems to have a constant supply of BMP‐2. The aim of this study was to standardize the heterologous expression of BMP‐2 and evaluate its osteoinductive activity in vitro. Our procedure for expression and purification was based on recombinant DNA technology using the plasmid pET‐28 and IPTG as inductor. After extracting the protein from inclusion bodies, folding it and modifying it via a redox system, we observed via electrophoresis a 26 kDa dimer. We evaluated its osteoinductive activity in myoblastic C2C12 by quantifying enzymatically the activity of alkaline phosphate (ALP) and staining mineralization nodules. ALP activity is proportional to BMP‐2 concentration, increasing 90% at 3 μg/mL. These cells form calcium nodules, mineralizing 50% of the area.

RESUMEN: Actualmente la proteína morfogénica ósea 2 (BMP‐2) es uno de los dos factores de crecimiento más osteoinductivos usado clínicamente en dispositivos médicos que promueve la formación de hueso. Normalmente esta proteína es comprada a altos precios y en cantidades pequeñas que no alcanzan a cubrir las necesidades clínicas. Debido a esto, se ha propuesto que centros de investigación utilicen sus propios sistemas heterólogos para obtener un suministro constante. El objetivo de este trabajo es estandarizar la expresión heteróloga de la BMP‐2 y evaluar su actividad osteoinductiva in vitro. Nuestro procedimiento para la expresión y purificación se basó en la tecnología de DNA recombinante usando el plásmido pET‐28 e IPTG como inductor. Después de extraer la proteína de los cuerpos de inclusión, renaturalizarla y modificarla usando un sistema redox, se observó mediante electroforesis un dímero de 26 kDa. Se evaluó su actividad osteoinductiva en células mioblásticas C2C12 cuantificando enzimáticamente la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) y realizando una tinción de los nódulos de mineralización. La actividad de la fosfatasa alcalina fue proporcional a la concentración de BMP‐2, obteniendo un aumento del 90 % a concentraciones de 3 μg/mL. Estas células formaron nódulos de calcio, mineralizando un 50 % la superficie.