Incorporación de Uracilo ADN glicosilasa / dUTPs en la reacción de PCR anidada para detectar Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax : una estrategia para reducir el riesgo de contaminación

Abstract

RESUMEN: La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se emplea en investigación y como prueba diagnóstica para confirmar la infección malárica en muestras clínicas. Por ser un método con una sensibilidad cercana a 100 %, es susceptible a la contaminación por amplicones, cuando se procesa un gran volumen de muestras, aumentando el riesgo de falsos positivos. Este estudio evaluó la incorporación del sistema uracilo ADN glicosilasa (UDG)‐dUTPs en la reacción de PCR anidada (nPCR) para Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax, como estrategia para prevenir la contaminación por amplicones en nuevas reacciones. Se empleó ADN de la cepa 3D7 de P. falciparum y una muestra clínica con infección confirmada por P. vivax. Se evaluó el efecto de reemplazar dTTPs por dUTPs en la reacción de nPCR y se verificó su efecto en el límite de detección. Se evaluó la acción degradante de la enzima UDG en reacciones de PCR contaminadas artificialmente con amplicones. Se cuantificó el ADN contaminante que fue capaz de degradar una unidad de UDG en este sistema. La sustitución de dTTPs por dUTPs no afectó la función de la Taq polimerasa, sin embargo, se observó una ligera disminución en la sensibilidad analítica de la nPCR cuando se incorporaron dUTPs. En reacciones contaminadas, la UDG fue capaz de degradar exclusivamente los amplicones contaminantes, sin afectar la amplificación del ADN nativo. Una unidad de UDG logró degradar completamente hasta 6 pg/μl de ADN contaminante. El sistema UDG‐dUTPs puede prevenir la contaminación para mejorar el diagnóstico molecular en malaria.