Isolation and functional characterization of a basic phospholipase A2 from Colombian Bothrops asper Venom

Abstract

ABSTRACT: Background: Snakebites represent a relevant public health issue in many regions of the world, particularly in tropical and subtropical countries of Africa, Asia, Latin America and Oceania. Snake venoms are complex mixtures of toxic enzymes and proteins, where the most important and abundant muscle-damaging components in snake venoms are phospholipases A2 (PLA2s). Objective: Isolate and characterize a phospholipase A2 from Colombian Bothrops asper venom, in order to obtain information about venom composition of this species. Materials and methods: Cation-exchange chromatogra phy followed by reverse phase HPLC were used to purify the protein. Mass spectrometry was used to determine its molecular mass. Biochemical characterization was performed using a synthetic substrate (4-nitro-3-octanoyloxy-benzoic acid). Myotoxic and edema-inducing activity of toxin were tested in mice, by measuring the plasma creatine kinase activity and footpad diameter, respectively. Moreover, cytotoxic activity was examined to murine skeletal muscle C2C12 myoblasts and myotubes. Results: A PLA2 of Bothrops asper venom from Colombia (BaspCol-PLA2) was purified. Its molecular mass was 13974.6 Da. The enzyme hydrolyzed a synthetic substrate with a KM of 3.11 mM and a VMax of 4.47 nmol/min, showing maximum activity at 40 °C and at pH 8.0. The PLA2 required Ca2+ for activity. The addition of Mg2+, Cd2+, Mn2+ and Zn2+ (10mM) in the presence of low Ca2+ concentration (1mM) decreased the enzyme activity. The substitution of Ca2+ by mentioned divalent cations also reduced the activity to levels similar to those in the absence of Ca2+. Three internal fragments (CCFVHDCCYGK, AAAI/ LCFRDNI/LNTYNDKK, DAAI/LCFR) identified by a mass spectrometry analysis showed similarity with previously reported B. asper PLA2s. In mice, BaspCol-PLA2 induced a conspicuous local myotoxic effect and moderate footpad edema. In vitro, this enzyme induced cytotoxic effect on both myoblasts and myotubes. Additionally, it was classified as weakly anticoagulant PLA2, showing this effect at concen trations between 3 and 10 μg/mL when using human plasma. Conclusions: A PLA2 was purified and named BaspCol-PLA2, this enzyme displayed catalytic activity and molecular mass of 13974.6 Da. The toxin showed myotoxic, edema-forming, anticoagulant and cytotoxic activities.

RESUMEN: Antecedentes: Los accidentes ofídicos representan un grave problema de salud pública en muchas regiones del mundo, particularmente en países tropicales y subtropicales de África, Asia, América latina y Oceanía. Los venenos de serpiente son mezclas complejas de enzymas y proteínas tóxicas, donde las fosfolipasas A2 (PLA2s) son uno de los principales y más abundantes componentes que destruyen el tejido muscular. Objetivo: Aislar y caracterizar una fosfolipasa A2 del veneno de Bothrops asper de Colombia, con el fin de obtener información acerca de la composición del veneno de esta especie. Materiales y Métodos: Se empleó cromatografía de intercambio catiónico seguida de HPLC en fase reversa para purificar la proteína. La masa molecular fue determinada por espectrometría de masas. La caracterización bioquímica fue llevada a cabo usando un sustrato sintético (ácido 4-nitro-3-octanoyloxi-benzoico). La actividad miotóxica y edematizante fue ensayada en ratones, al medir la actividad de la creatina kinasa en plasma y el aumento del diámetro de la almohadilla plantar, respectivamente. Además, la actividad citotóxica fue examinada en mioblastos y miotubos murinos C2C12. Resultados: Fue purificada una fosfolipasa A2básica (BaspCol-PLA2) del veneno de Bothrops asper de Colombia. Su masa molecular fue 13974,6 Da. La enzima hidrolizó un sustrato sintético con un KM de 3,11 mM y un VMax de 4,47 nmol/ min, mostrando actividad máxima a 40 °C y pH 8,0. La PLA2 requirió Ca2+ para su actividad. La adición de Mg2+, Cd2+, Mn2+ y Zn2+ (10mM) en presencia de una baja concentración de Ca2+ (1mM) disminuyó la actividad enzimática. La sustitución de Ca2+ por otros cationes divalentes también redujo la actividad a niveles similares a aquellos presentados en ausencia de Ca2+. Tres péptidos internos (CCFVHDCCYGK, AAAI/LCFRDNI/LNTYNDKK, DAAI/LCFR) identificados por espectrometría de masas mostraron similitud con otras fosfolipasas A2 de B. asper previamente descritas. Cuando BaspCol-PLA2 fue inyectada en ratones indujo una miotoxicidad local considerable y un edema moderado. In vitro, esta enzima provocó efecto citotóxico sobre mioblastos y miotubos. Adicionalmente, esta proteína fue débilmente anticoagulan te, mostrando este efecto sobre plasma humano en concentraciones entre 3 y 10 μg/mL. Conclusiones: Una PLA2 fue purificada y llamada BaspCol-PLA2, esta enzima presentó actividad catalítica y una masa molecular de 13974,6 Da. La toxina mostró actividad miotóxica, edematizante, anticoagulante y citotóxica.