Diseño y evaluación de una prueba de PCR para detección de Brucella spp y B abortus

Abstract

ABSTRACT: Problem: brucelosis is a zoonosis that affects livestock and livestock workers. This disease is characterized by the difficulties for its early diagnosis. Sensitivity of marrow and blood cultures as well as serological tests (Rose Bengal and ELISA) ranges between 15 and 70%, depending on the stage of infection. Development of rapid, sensitive, and specific diagnostic methods using molecular techniques such as PCR would allow timely diagnose and treatment of the disease. Objective: To develop and evaluate two PCR tests for detection of Brucella spp. and B. abortus.Materials and methods: primers to detect ugpA gene were designed and evaluated using Primer3 and others reported in the literature. Sensitivity and specificity were calculated for 3 groups (G) of human and bovine samples using Bayes’ theorem. G1 consisted of healthy human and healthy bovine samples (30 serum and 30 blood samples of each species); bovine blood samples were inoculated with Brucellaabortus. G2 consisted of healthy human and healthy bovine samples (30 serum and 30 blood samples of each); bovine blood samples were inoculated with Salmonella typhi, Escherichia coli, Klebsiella sp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia,and Enterococcus sp. G3 consisted of 60 serum and 60 blood samples from asymptomatic bovines, as well as 60 serum and 60 blood samples from asymptomatic humans. Results: sensitivity and specificity of the PCR test to detect Brucella sp. and Brucella abortus reached 100% in human and bovine samples. Conclusiones: considering the high sensitivity and specificity observed in the PCR tests studied, we recommend doing a follow up of the test in a clinical trial to evaluate its performance in infected humans and animals.

RESUMEN: Problema: el diagnóstico oportuno de la brucelosis, zoonosis que afecta ganado y trabajadores pecuarios, es difícil. Las pruebas serológicas Rosa de Bengala y ELISA, el hemocultivo y mielocultivo, tienen sensibilidades entre 15-70% dependiendo del estadío de la infección. El desarrollo de métodos diagnósticos rápidos, sensibles y específicos utilizando técnicas moleculares como la PCR, permite diagnosticar y tratar oportunamente esta enfermedad. Objetivo:Desarrollar y evaluar dos pruebas de PCR para detección de Brucella spp. y B. abortus. Materiales y métodos: se diseñaron y evaluaron iniciadores para detectar el gen ugpA utilizando Primer3, y otros reportados en la literatura. Se calculó sensibilidad y especificidad, usando 3 grupos (G) de muestras humanas y bovinas utilizando el teorema de Bayes: G1:30 muestras de suero y 30 de sangre de humanos sanos y 30 de suero y 30 de sangre de bovinos sanos, inoculadas con Brucellaabortus; G2: 30 muestras de suero y 30 de sangre de humanos sanos y 30 de suero y de 30 sangre de bovinos sanos inoculadas con Salmonella Typhi, Escherichia coli, Klebsiella sp., Psudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Enterococcus sp. G3: 60 muestras de suero y 60 sangre de bovinos y 60 muestras de suero y 60 sangre de humanos asintomáticos. Resultados: se obtuvo una sensibilidad y especificidad de detección de Brucella sp. y Brucella abortus del 100% en muestras humanas y bovinas. Conclusiones: por la alta sensibilidad y especificidad encontradas en las pruebas de PCR estudiadas, se recomienda continuar un estudio clínico de aplicación para evaluar su comportamiento en muestras de pacientes y animales infectados.

RESUMO: Problema: é difícil o diagnostico oportuno da brucelose, zoonose que afeta o gado e os trabalhadores pecuários. Os testes serológicos Rosa de Bengala e ELISA, e a hemocultura e mielocultura têm sensibilidades entre 15 e 70% dependendo do estádio da infecção. O desenvolvimento de métodos diagnósticos rápidos, sensíveis e específicos utilizando técnicas moleculares como a PCR, permite diagnosticar e tratar oportunamente esta doença. Objetivo: desenvolver e avaliar dois testes de PCR para a detecção de Brucella spp. e B. abortus. Materiais e métodos. Desenharam-se e avaliaram-se iniciadores utilizando o software Primer3 para detectar o gene ugpA, também se avaliaram outros iniciadores reportados previamente na literatura. Calculou-se a sensibilidade e especificidade do teste por PCR usando três grupos (G) de amostras humanas e bovinas utilizando o teorema de Bayes: G1: 30 amostras de soro e 30 de sangue de humanos sãos e 30 de soro e 30 de sangue de bovinos sãos, inoculadas com Brucella abortus; G2: 30 amostras de soro e 30 de sangue de humanos sãos e 30 de soro e de 30 sangue de bovinos sãos inoculadas com Salmonella Typhi, Escherichia coli, Klebsiella sp., Psudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae e Enterococcus sp. G3: 60 amostras de soro e 60 de sangue de bovinos e 60 amostras de soro e 60 sangue de humanos assintomáticos. Resultados. Obteve-se uma sensibilidade e especificidade de detecção da Brucella spp. e Brucella abortus de 100% em amostras humanas e bovinas. Conclusões: pela alta sensibilidade e especificidade encontrada com o teste de PCR estudado, recomenda-se continuar um estudo clínico de aplicação para avaliar seu comportamento em amostras de pacientes e animais infetados.