Mantenimiento de la inactivación del cromosoma X : exploración con RNA-interferente contra el gen de susceptibilidad a cáncer de mama (BRCA1)

Abstract

RESUMEN: La inactivación del cromosoma X (XCI) es un evento epigenético que suprime muchos genes en uno de los dosX en los mamíferos hembras. El mantenimiento de ese estado excepcional de herencia somática depende en partedel remodelamiento de la cromatina. Hace tres décadas publicamos la primera evidencia de la existencia de dosXaen células de cáncer de mama. Y evidencias recientes involucran a la proteína BRCA1 con remodelacióncromatínica. Partiendo de estas observaciones, una citogenética y otra molecular, planteamos la posible relaciónentre BRCA1 y XCI. Para investigarlo, se abrogó la expresión de BRCA1 en células XiXa, utilizando shRNAscontra el mRNA de la proteína BRCA1. De los clones recombinantes en DH5alpha, se extrajeron los plásmidospsiSTRIKE-Neo-shRNAs, y con ellos se lipo-transfectaron células XiXa. Mediante Western-blot se confi rmó elsilenciamiento de la proteína BRCA1. Con la secuencia Sh2-RNA de mayor grado de silenciamiento anti BRCA1,se encontró expresión QRT-PCR aumentada en las transfectadas, y para los genes POLA1, PGK1 y OCRL ligadosa regiones que no escapan a la inactivación, y para el gen control ZFX que normalmente si escapa a la inactivación(control interno).En conclusión, aunque el RNAi anti-BRCA1 no afecta la metilación de promotores de los genes examinadossinténicos al X, si perturba sus niveles de expresión, sugiriendo que BRCA1 si puede afectar el estado de mante-nimiento de inactivación de esos loci, lo cual no es incompatible con la postulada acción epigenética de BRCA1sobre la remodelación de la cromatina

ABSTRACT: X chromosome inactivation (XCI) is an epigenetic event that suppresses many genes in one of the two X in fe-male mammals. Maintenance of this exceptional state of somatic inheritance depends partly on the remodeling ofchromatin. Three decades ago we published the fi rst evidence of the existence of twoXa in breast cancer cells.And recent evidence involves the BRCA1 protein with chromatin remodeling. Based on these evidences at themolecular and cytogenetic level, we proposed a possible relationship between BRCA1 and XCI. To investigatethese clues, BRCA1 expression was abrogated on XiXa cells using shRNAs against the mRNA of the BRCA1protein. From the DH5alpha recombinant clones, psiSTRIKE-Neo-shRNAs plasmids were extracted, and used tolipo-transfect XiXa cells. Silencing of the BRCA1 protein was confi rmed by Western blot. With the Sh2-RNA thatgenerated the greater degree of silencing, through QRT-PCR in transfected cells we found increased expression ofPOLA1, PGK1 and OCRL genes linked to regions of the Xi that do not scape inactivation, and for the ZFX genewhich normally escapes inactivation (internal control).In conclusion, and although the anti-BRCA1 RNAis employed did not affected the epigenetic methylation stateof X-linked genes examined, it does perturb their expression levels, suggesting that BRCA1 could affect the stateof inactivation of those Xi-linked loci, which is compatible with the postulated epigenetic action of BRCA1 onchromatin remodeling.