Efecto antimicótico de un nanobioconjugado de itraconazol frente al tratamiento convencional en un modelo in vitro de histoplasmosis

Abstract

RESUMEN: La Histoplasmosis (HPM) es una micosis de importancia en América Latina que puede afectar tanto individuos inmunosuprimidos como inmunocompetentes. Su tratamiento representa un reto debido entre otras cosas, a la dificultad para alcanzar dosis adecuadas a nivel intracelular y a las interacciones farmacológicas que pueden presentarse en algunos pacientes polimedicados, lo cual hace que se requieran dosis repetidas durante largo plazo y se ocasionen efectos adversos como hepatotoxicidad. La nanomedicina permite encapsular fármacos, dirigirlos selectivamente a poblaciones celulares específicas y ofrecer una liberación sostenida en el sitio objetivo, alcanzando así niveles terapéuticos intracelulares que ayudan a minimizar los efectos secundarios, las interacciones no deseadas y demás problemas de la terapia convencional. En el presente estudio se evaluó ITZ encapsulado en NPs de PLGA funcionalizadas con anticuerpos anti F4/80 para su liberación dirigida y controlada en macrófagos infectados con el hongo H. capsulatum. El método de microdilución para levadura (M27-A3) y el ensayo MTT permitieron determinar que la CMI es 0,015 μg/mL para NPs-ITZ y NPs-ITZ-F4/80. El ensayo de citotoxicidad, demostró que ninguna de las concentraciones utilizadas de ITZ libre, encapsulado en NPs y funcionalizado con anticuerpos anti F4/80 fue tóxica para los macrófagos J774A.1, las cuales mantuvieron una viabilidad > 80%. La cuantificación de unidades formadoras de colonias (UFC) mostró que el tratamiento con ITZ encapsulado y funcionalizado (NPs-ITZ-F4/80) proporciona un mayor efecto antimicótico contra H. capsulatum en co-cultivo con macrófagos J774A.1. Cabe destacar que dicha nanoformulación redujo significativamente el número de UFC en comparación con el ITZ encapsulado sin funcionalizar (NPs-ITZ). La microscopía de fluorescencia confirmó que existe una mayor captación celular de las NPs cuando están funcionalizadas en comparación con las NPs sin funcionalizar, lo cual sugiere que la efectividad del tratamiento con NPS-ITZ-F4/80 observado en los ensayos de UFC, puede deberse a un aumento en la concentración de ITZ a nivel intracelular. Adicionalmente, los análisis de PCR en tiempo real evidenciaron que el tratamiento con las nanoformulaciones de ITZ (NPs-ITZ y NPs-ITZ-F4/80) redujeron significativamente la expresión de IL-1β, IL-6 e IL-10 en comparación con el ITZ libre. Sin embargo, esta expresión se redujo aún más cuando las nanocápsulas se funcionalizaron con anticuerpos anti F4/80, indicando que los anticuerpos podrían ejercer un efecto inmunomodulador adicional.

ABSTRACT: Histoplasmosis (HPM) is an important mycosis in Latin America that can affect both immunosuppressed and immunocompetent individuals. Its treatment represents a challenge due (among other reasons) to the difficulty in reaching adequate doses at the intracellular level and to the pharmacological interactions that can occur in some polymedicated patients requiring repeated doses over a long period of time and causing side effects such as hepatotoxicity. Nanomedicine allows drug encapsulation, selectively target them to specific cell populations and provide sustained release at the target site reaching intracellular therapeutic levels that help minimize side effects as well as unwanted interactions and other problems of conventional therapy. In the current study ITZ encapsulated in PLGA NPs functionalized with anti-F4/80 antibodies was evaluated for its targeted and controlled release in macrophages infected with H. capsulatum. The microdilution method for H. capsulatum yeast (M27-A3) and the MTT assay showed that the MIC is 0.015 μg/mL for NPs-ITZ and NPs-ITZ-F4/80. The cytotoxicity technique proved that none of the concentrations used of free ITZ, encapsulated in NPs and/or functionalized with the anti-F4/80 antibody was toxic to J774A.1 macrophages which maintained > 80% viability. The quantification of Colony Forming Units (CFU) showed that treatment with encapsulated and functionalized ITZ (NPs-ITZ-F4/80) provides a greater antifungal effect against H. capsulatum in co-culture with J774A.1 macrophages. This nanoformulation significantly reduced the number of CFUs compared to the non-functionalized encapsulated ITZ (NPs-ITZ). Fluorescence microscopy confirmed that there is a higher cellular uptake of NPs when functionalized are compared to non-functionalized NPs, suggesting that the effectiveness of NPS-ITZ-F4/80 treatment observed in the CFU trials may be due to an increase in the concentration of ITZ at the intracellular level. Additionally, real-time PCR analysis showed that treatment with ITZ nanoformulations (NPs-ITZ and NPs-ITZ-F4/80) significantly reduced the expression of IL-1β, IL-6 and IL-10 compared to free ITZ. However, this expression was further reduced when nanocapsules were functionalized with anti-F4/80 antibodies, indicating that the antibodies could exert an additional immunomodulatory effect.