Citometría de flujo en reticulocitos de sangre periférica como indicador de inestabilidad cromosómica en pacientes con gliomas de alto grado

Abstract

RESUMEN: Introducción. La cuantificación de la inestabilidad cromosómica es un parámetro importante para evaluar la genotoxicidad y la radiosensibilidad. Las técnicas convencionales requieren cultivos celulares o laboriosos análisis microscópicos de cromosomas o núcleos. La citometría de flujo en reticulocitos ha surgido como una alternativa para los estudios in vivo, ya que reduce los tiempos de análisis e incrementa hasta en 20 veces el número de células analizables. Objetivos. Estandarizar los parámetros de citometría de flujo requeridos para seleccionar y cuantificar reticulocitos micronucleados (RET-MN) a partir de muestras de sangre periférica, y cuantificar la frecuencia de esta subpoblación anormal como medida de inestabilidad citogenética en sendas poblaciones de voluntarios sanos (n=25) y pacientes (n=25) recién diagnosticados con gliomas de alto grado antes de iniciar el tratamiento. Materiales y métodos. Las células sanguíneas se marcaron con anti-CD71-PE para reticulocitos, anti-CD61-FITC para la exclusión de plaquetas y yoduro de propidio para detectar el ADN en reticulocitos. La fracción celular MN-RETCD71+ se seleccionó y se cuantificó con un citómetro de flujo automático. Resultados. Se describió detalladamente la estandarización de los parámetros citométricos, con énfasis en la selección y la cuantificación de la subpoblación celular MN-RETCD71+. Se establecieron los niveles basales de MN-RETCD71+ en la población de control y en los pacientes se encontró un incremento de 5,2 veces antes de iniciar el tratamiento (p<0,05). Conclusión. Los resultados evidenciaron la utilidad de la citometría de flujo acoplada a la marcación de las células RETCD71+ como método eficiente para cuantificar la inestabilidad cromosómica in vivo. Se sugieren posibles razones del incremento de micronúcleos en células RETCD71+ de pacientes con gliomas.

ABSTRACT: Introduction: The quantification of chromosomal instability is an important parameter to assess genotoxicity and radiosensitivity. Most conventional techniques require cell cultures or laborious microscopic analyses of chromosomes or nuclei. However, a flow cytometry that selects the reticulocytes has been developed as an alternative for in vivo studies, which expedites the analytical procedures and increases up to 20 times the number of target cells to be analyzed.Objectives: To standardize the flow cytometry parameters for selecting and quantifying the micronucleated reticulocytesCD71+ (MN-RET) from freshly drawn peripheral blood and to quantify the frequency of this abnormal cell subpopulation as a measure of cytogenetic instability in populations of healthy volunteers (n =25), and patients (n=25), recently diagnosed with high-grade gliomas before the onset of treatment.Materials and methods: Blood cells were methanol-fixed and labeled with anti-CD-71-PE for reticulocytes, antiCD-61-FITC for platelet exclusion, and propidium iodide for DNA detection in reticulocytes. The MN-RETCD71+ cell fraction was selected and quantified with an automatic flow cytometer.Results: The standardization of cytometry parameters was described in detail, emphasizing the selection and quantification of the MN-RETCD71+ cellularfraction. The micronuclei basal level was established in healthy controls. In patients, a 5.2-fold increase before the onset of treatment was observed (p <0.05).Conclusion: The data showed the usefulness of flow cytometry coupled with anti-CD-71-PE and anti-CD-61-FITC labeling in circulating reticulocytes as an efficient and high resolution method to quantify chromosome instability in vivo. Finally, possible reasons for the higher average of micronuclei in RETCD71+ cells from untreated high-grade glioma patients were discussed.