Inducción de muerte celular del neutrófilo (NETosis) por cocaína-levamisol y sus posibles mecanismos como evento disparador de Vasculopatías

Abstract

RESUMEN: INTRODUCCIÓN: Desde 2010 se reportan casos de una nueva vasculopatía inducida por el consumo de cocaína contaminada con levamisol (VICOL), caracterizada por púrpura retiforme, necrosis de pabellones auriculares, compromiso multisistémico y positividad para múltiples autoanticuerpos. Se conocía la capacidad del levamisol de inducir reacción inmunológica con lesiones cutáneas y se habían descrito eventos con Cocaína; por la similitud que tiene la VICOL con la vasculitis asociada a anticuerpo anticitoplasma del neutrófilo se postula que pudieran compartir fisiopatologías entre ellas, así como la participación de neutrófilos y su muerte por NETosis. METODOLOGÍA: Neutrófilos de controles sanos fueron aislados por gradiente de densidad Ficoll-Dextran 3%, la viabilidad celular y pureza fueron evaluadas utilizando PI, DiOC6, y CD45-PCy7, CD33-PE respectivamente. La inducción de muerte celular fue evaluada mediante el tratamiento con Cocaína, Levamisol, Cocaína-Levamisol, mezcla de suero de individuos control y mezcla de suero de pacientes VICOL. La cuantificación de NETosis se realizó mediante un método recientemente descrito, citometría de flujo, utilizando Sytox green, Hoechst-33342. anti- elastasa del neutrófilo (EN) y anti- mieloperoxidasa (MPO). La confirmación de este tipo de muerte se hizo al evaluar la morfología por microscopia de fluorescencia. La medición de especies reactivas de oxígeno (ROS) se realizó mediante citometría de flujo utilizando dihidrorodamina 123 (DHR-123) y para evaluar la participación de calcio o los receptores muscarínicos se utilizaron como inhibidores BAPTA y Butilbromuro de hioscina (BBH), respectivamente. RESULTADOS: La inducción de muerte celular fue observada en neutrófilos estimulados con Cocaína y Levamisol de forma individual, además de un efecto sinérgico en la inducción de NETosis al utilizar estos dos compuestos combinados. Aunque no se detectó la presencia de EN, la detección de ácido desoxirribonucleico (ADN) extracelular, el patrón morfológico evidenciado en el registro fotográfico por microscopia de fluorescencia y la presencia de MPO son sugestivas de NETosis. Resultados preliminares con los inhibidores sugieren la participación de las vías dependientes de calcio y de receptores muscarínicos. CONCLUSIÓN: Estos resultados validan la citometría de flujo como una técnica útil para la evaluación de NETosis, además muestran la capacidad de la Cocaína y el Levamisol de inducir NETosis. También, nos sugieren que la vía de calcio y la participación de los receptores muscarínicos como posibles mecanismos de inducción de este tipo de muerte generada por Cocaína- Levamisol

ABSTRACT: INTRODUCTION: Since 2010, there have been reported cases of a new vasculopathy induced by the consumption of cocaine contaminated with levamisole (VICOL), characterized by retiform purpura, bilateral earlobe necrosis, multisystem involvement, and positivity for multiple autoantibodies. The ability of levamisole to induce an immunological reaction with skin lesions was known and there had been described events with cocaine. Due to the similarity of VICOL with vasculitis associated with anti-neutrophil cytoplasmic antibody, it is postulated that they could share pathophysiologies, as well as the participation of neutrophils and their death by NETosis. METHODOLOGY: Neutrophils from healthy controls were isolated by 3% Ficoll-Dextran density gradient, cell viability and purity were assessed using PI, DiOC6, and CD45-PCy7, CD33-PE respectively. Cell death induction was assessed by treatment with Cocaine, Levamisole, Cocaine-Levamisole, serum mixture from control individuals and serum mixture from VICOL patients. Quantification of NETosis was performed by a recently described method that employs flow cytometry, using Sytox green, Hoechst-33342, anti-neutrophil elastase (NE) and anti-myeloperoxidase (MPO). Confirmation of this type of death was made by assessing morphology with fluorescence microscopy. Measurement of ROS was performed by flow cytometry using DHR-123, and to evaluate the involvement of calcium or muscarinic receptors, BAPTA and hyoscine butylbromide were used as inhibitors, respectively. RESULTS: Induction of cell death was observed in neutrophils stimulated with Cocaine and Levamisole individually, in addition to a synergistic effect in the induction of NETosis when using these two compounds in combination. Although the presence of NE was not detected, the detection of extracellular DNA, the morphological pattern evidenced in the photographic record by fluorescence microscopy and the presence of MPO are suggestive of NETosis. Preliminary results with inhibitors suggest the involvement of calcium-dependent pathways and muscarinic receptors. Conclusion: These results validate flow cytometry as a useful technique for the evaluation of NETosis and show the ability of Cocaine and Levamisole to induce NETosis. Also, they suggest the calcium pathway and the participation of muscarinic receptors as possible mechanisms of induction of this type of death generated by Cocaine-Levamisole.