Los inhibidores quinasa reducen la proteína c-Abelson fosforilada (c-abl-p) inducida por el H2O2 en un modelo neuronal colinérgico: implicaciones en la enfermedad de Alzheimer

Abstract

RESUMEN: La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo crónico caracterizado clínicamente por la pérdida de la memoria, y neuropatológicamente, por la presencia de placas del péptido B-amiloide (AB), ovillos neurofibrilares, gliosis y pérdida neuronal principalmente de las neuronas colinérgicas. Estos fenómenos celulares y moleculares son potenciados por el estrés oxidativo (EO) que finalmente conducen a la muerte de las neuronas colinérgicas en el hipocampo. Recientemente, el EO, se ha asociado con la proteína tirosina quinasa celular Abelson (c-Abl), como molécula diana desencadenante del deterioro neuronal por daño de lípidos, proteínas, ácidos nucleicos y aumento del Ca 2+ intracelular. En este contexto, se ha demostrado en modelos in vivo, que c-Abl se encuentra activada en neuronas expuestas al péptido AB y al peróxido de hidrogeno (H2O2), y que su señalización está asociada a EO, y a muerte neuronal. Por lo tanto, se ha propuesto a la proteína c-Abl como posible blanco terapéutico en el diseño de tratamientos para la EA. De hecho, se ha evidenciado que los inhibidores farmacológicos de c-Abl, como el nilotinib, previene el EO, las alteraciones sinápticas inducidas por AB, la fosforilación de TAU, la neurodegeneración y el deterioro cognitivo. Sin embargo, a pesar de estos avances hasta el presente, no se cuenta con una terapia efectiva que reduzca los síntomas y la neuropatología que presentan los pacientes con la EA. De igual forma, no se ha establecido con precisión cuál es la relación entre el EO, la proteína c-Abelson, y su regulación con los inhibidores quinasa en un modelo neuronal colinérgico en condiciones de EO. Por lo anterior, en este trabajo nos propusimos establecer un protocolo de detección de activación de la c-Abl-fosforilada (c-Abl-p) y evaluar el efecto de los inhibidores de quinasa en función de la activación de la proteína c-Abl-p y el EO inducidos por el H2O2 en un modelo neuronal colinérgico de la EA. Con el objetivo de establecer un modelo celular semejante a neuronas colinérgicas (NC), se utilizaron células estromales mesenquimales (CEM) silvestres (WT) obtenidas a partir de cordón umbilical (CEM-CU) que fueron transdiferenciadas a neuronas colinérgicas y su posterior evaluación de activación de la c-Abl a través de la estimulación con el H2O2 .En este contexto, las células transdiferenciadas a NC mostraron marcadores neuronales, colinérgicos como MAP-2, NF-L, β-tubulina III, ChAT, VAChT, y negativo para la proteína acida fibrilar glial (por su sigla en inglés, glial fibrilar acidic protein, GFAP) respectivamente por microscopia de fluorescencia (MF) y que posteriormente fueron expuestas al H2O2 y evaluadas en función de la expresión y activación del marcador de la proteína quinasa cAbl en presencia de los inhibidores específicos de primera (v.gr.imatinib), segunda (v.gr.dasatinib, bosutinib y nilotinib), y tercera generación (v.gr.ponatinib). Como resultado de este trabajo de investigación, inicialmente se estableció el protocolo de activación de c-Abl inducido por 100uM de H2O2 por un intervalo de tiempo entre 30 minutos (30 min) a 12horas (hrs) de exposición al H2O2 en el modelo de NC. El Análisis de los datos evidenció que 100uM de H2O2 aumentó la activación de la quinasa c-Abl (⁓ 1.3-f.c. (fold change)), la oxidación DJCys106SO3 (⁓ 7.5-f.c.), y disminuyó el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) comparadas con las NC no tratadas. Además, estos hallazgos revelaron que la concentración de 25nM de los inhibidores de la proteína quinasa c-Abl fueron inocuas para las NC. En este contexto, se demostró que los 5 inhibidores fueron significativamente capaces de proteger a las NC del daño del ΔΨm y disminuir los niveles de c-Abl-p-Y412, siendo los más potentes el nilotinib, imatinib y ponatinib (⁓-0.80-f.c, ⁓-0.68-f.c y ⁓-0.54-f.c respectivamente) comparados con las NC expuestas solamente al H2O2. También se evidenció que los inhibidores nilotinib, imatinib y bosutinib fueron los más efectivos en la reducción significativa de la oxidación de la proteína DJ-1Cys106SO3 (⁓-0.91-f.c, ⁓-0.87-f.c y ⁓-0.86-f.c respectivamente), al compararlos con las NC expuestas al H2O2. En este trabajo, se estandarizó por primera vez un protocolo de activación de la quinasa cAbl-p-Y412 por H2O2 en un modelo neuronal colinérgico NC. También se evidenció que los inhibidores de quinasas nilotinib, dasatinib, ponatinib, imatinib y bosutinib son neuroprotectores y restauradores de la funcionalidad mitocondrial vía disminución de los niveles de la c-Abl-p y de la reducción de los niveles de la oxidación de la proteína DJ-1 y la caspasa 3. Estos hallazgos permiten sugerir a la proteína c-Abl como un blanco terapéutico de estudio, brindando una alternativa promisoria para la selección y el diseño de moléculas en el tratamiento de la EA.

ABSTRACT: Alzheimer's disease (AD) is a chronic progressive neurodegenerative disorder characterized clinically by memory loss, and neuropathologically, by the presence of β-amyloid peptide (Aβ) plaques, neurofibrillary tangles, gliosis and neuronal loss, mainly of neurons. cholinergic. These cellular and molecular events are potentiated by oxidative stress (OS) that ultimately lead to death of cholinergic neurons in the hippocampus. Recently, EO has been associated with the Abelson cell protein tyrosine kinase (c-Abl), with the induction of neuronal deterioration due to lipid, protein, and nucleic acid damage and an increase in intracellular Ca 2+. In this context, it has been shown in vivo models that c-Abl is activated in neurons exposed to Aβ peptide and hydrogen peroxide (H2O2), and that it is signaling is associated with OS and neuronal death. Therefore, the c-Abl protein has been proposed as a possible therapeutic target in the design of treatments for AD. In fact, pharmacological inhibitors of cAbl, such as nilotinib, have been shown to prevent OS, Aβ -induced synaptic alterations, TAU phosphorylation, neurodegeneration, and cognitive impairment. However, despite these advances to date, there is no effective therapy that reduces the symptoms and neuropathology presented by patients with AD. Similarly, the relationship between OS, the cAbelson protein, and its regulation with kinase inhibitors in a cholinergic neuronal model under oxidative stress conditions has not been precisely proved. Therefore, in this work we set out to show a protocol for detecting the activation of c-Ablphosphorylated (c-Abl-p-Y412) and to evaluate the effect of kinase inhibitors on c-Abl-p and induced OS. by H2O2 in a cholinergic neuronal model of AD. To prove a cell model like cholinergic neurons (NC), wild-type mesenchymal stromal cells (CEM) were used, obtained from the umbilical cord (CEM-UC) that were transdifferentiated to cholinergic neurons and their later evaluation of activation of c-Abl through stimulation with H2O2. In this context, cells transdifferentiated to NC showed neuronal, cholinergic markers such as MAP-2, NF-L, β-tubulin III, ChAT, VChAT, and negative for the glial fibrillary acidic protein (for its acronym in English, glial fibrillary acidic protein, GFAP) respectively by fluorescence microscopy (MF) and that were subsequently exposed to H2O2 and evaluated based on the expression and activation of the protein kinase c marker -Abl in the presence of specific inhibitors of the first (v.gr.imatinib), second (v.gr.dasatinib, bosutinib and nilotinib), and third generation (v.gr.ponatinib). As a result, the establishment of the c-Abl activation protocol induced by 100uM H2O2 was shown for a time interval between 30 minutes (30 min) to 12 hours (hrs) of exposure to H2O2 in the NC model. Data analysis showed that 100uM H2O2 increases c-Abl kinase activation (⁓ 1.3-f.c. (fold change)), DJCys106SO3 oxidation (⁓ 7.5-f.c.), and decreases mitochondrial membrane potential (ΔΨm) compared to untreated NC. Furthermore, they revealed that 25nM concentration of c-Abl protein kinase inhibitors were harmless to NC. In this context, it as shown that the 5 inhibitors were significantly able to protect NC from ΔΨm damage and decrease c-Abl-p levels, the most potent being nilotinib, imatinib and ponatinib (⁓-0.80-f.c, ⁓-0.68-f.c and ⁓-0.54-f.c respectively) compared to H2O2 treatment alone and that the inhibitors nilotinib, imatinib and bosutinib were the most effective in significantly reducing oxidation of the protein DJ-1Cys106SO3 (⁓-0.91 -f.c, ⁓-0.87-f.c and ⁓-0.86-f.c respectively), in NC exposed to H2O2.In this work, a protocol for activation of c-Abl-p-Y412 kinase by H2O2 in a cholinergic NC neuronal model was standardized for the first time. It was also shown that the kinase inhibitors nilotinib, dasatinib, ponatinib, imatinib and bosutinib are neuroprotective and restore mitochondrial functionality by decreasing c-Abl-p levels and reducing the levels of DJ-1 protein oxidation and caspase 3. These findings suggest c-Abl protein as a therapeutic target for study, providing a promising alternative for the selection and design of molecules in the treatment of AD.