Calibración in situ del indicador fluorecente mag-fluo-4 en células musculares de ratón

Abstract

RESUMEN: Introducción: La dinámica del El Ca2+ citoplasmático en el mecanismo de acoplamiento excitación contracción de las células musculares se puede registrar utilizando indicadores fluorescentes como el Mag-Fluo-4. Los registros obtenidos con este indicador no se han presentado en términos de concentración de Ca2+, pues no se conocen algunos parámetros del indicador in situ. Objetivo: Determinar in situ los parámetros que permitan calibrar las señales de fluorescencia obtenidas con Mag-Fluo-4 a valores de Ca2+ en células musculares. Metodología: Se obtuvieron células del músculo FDB por disociación enzimática de 16 ratones C57BL/6J, se montaron en un microscopio invertido acoplado a una lámpara LED, un juego de filtros, un fotomultiplicador y un digitalizador para registrar las señales. Las células se cargaron con 6 µM de Mag-Fluo-4, AM por 10 min a temperatura ambiente y se registraron los transitorios de fluorescencia de Ca2+, se permeabilizaron con Saponina (o con Ionomicina en un subgrupo de células) y se expusieron a Tyrode 0 mM de Ca2+, solución calibradora de Ca2+ o Tyrode 100 mM de Ca2+. A partir de estos valores se expresaron los transitorios de fluorescencia de Ca2+ en términos de la concentración de Ca2+. Resultados: Las células presentaron una autofluorescencia de 0,046±0,013 U.A. (n=6). Determinamos in situ que el Mag-Fluo-4 tiene una Fmin corregida (n=10) de 0,14±0,097 U.A, una compartimentalización del 1,1±0,7 % (n=10), una Kd de 118,9 µM, una Fmáx corregida de 150,889±8,798 U.A. (n=8) al permeabilizar con Saponina y de 102±27,402 U.A. (n=9) con Ionomicina. Calculamos una concentración de Ca2+ libre basal en el citoplasma de 171±0,008 nM y un pico en la concentración de Ca2+ libre tras el estímulo eléctrico de 17,37±4,1 µM (n=14). Conclusiones: Logramos determinar los parámetros in situ del Mag-Fluo-4 en células de FDB y expresar los transitorios de fluorescencia de Ca2+ en términos de concentración de Ca2+.