Efecto modulador de los monocitos CD14+CD16++ Slan+ sobre los monocitos CD14++CD16-

Abstract

RESUMEN: Introducción: Los monocitos son células derivadas de médula ósea que circulan en la sangre y presentan una alta plasticidad con capacidad de diferenciarse a macrófagos o células dendríticas, por lo que son morfológica y funcionalmente heterogéneas. Participan y regulan procesos de respuestas inmunes innatas como adaptativas. Convencionalmente, se han definido tres poblaciones diferentes basadas en la expresión de CD14 y CD16, monocitos clásicos, no clásicos e intermedios. Los monocitos no clásicos poseen una heterogeneidad adicional, una subpoblación que expresa una modificación de la glicoproteína P- selectina 1 (PSGL-1) a la cual se une un azúcar estructurado llamado 6-sulfo- LacNAc, esta subpoblación monocítica constituye la población de monocitos Slan+, la cual se ha asociado con el desarrollo de procesos inflamatorios, fundamentalmente. Nuestro Grupo previamente informó sobre la capacidad de las células no clásicas de regular la activación de los linfocitos T en individuos sanos y de su disfuncionalidad en los pacientes con lupus eritematoso sistémico. Adicionalmente, se ha reportado que pueden modular otras poblaciones celulares, dependiendo del estímulo y la proporción en la que se encuentren, lo que podría modular respuestas diferentes a las subpoblaciones CD16+Slan-. Por lo anterior, proponemos evaluar la respuesta in vitro mediante cultivos en los que se reconstituyen a proporciones definidas los monocitos CD16+Slan+ y monocitos CD14+CD16- y se exponen, independientemente, a estímulos contrastantes como el LPS y los cuerpos apoptóticos para evaluar la influencia de esta subpoblación en la respuesta de los monocitos reconstituidos y de linfocitos T CD3+ en co-cultivos de monocitos y en presencia dey cuerpos apoptóticos. Metodología: A partir de 60 mL de sangre periférica se aislaron los monocitos Slan+ y Slan- mediante separación electromagnética con enfoque hidrodinámico. Las células Slan- se marcaron con CSFE y se reconstituyeron en cultivo con las células Slan+ a diferentes proporciones (Slan+: Slan-; 0:100.000, 10.000:90.000, 40.000:60.000). Los cultivos se estimularon con LPS y cuerpos apoptóticos de la línea K562. Después de 48 horas de cultivo se evaluó la expresión del HLA-DR, CCR5, CD68, CD69. Mediante citometría de flujo se evaluó la proliferación mediante la dilución del CFSE en linfocitos T CD3+ y se agregaron a los co-cultivos reconstituidos con células Slan+ y Slan-. Estos se estimularon con PHA-L y cuerpos apoptóticos. Se evaluó el porcentaje de división de los linfocitos CD4 y CD8 luego de 120 horas. Mediante Lúminex, se evaluó la concentración de citocinas TNF-α, IL-6, IL-12, IL-10, IL-23, IL-1β y MCP-1 acumuladas en los ensayos de reconstitución; y las citocinas IL-2, INF-, IL-13, IL-10 e IL-17, acumuladas en ensayos de proliferación. Resultados: Tras el co-cultivo con diferentes proporciones de monocitos Slan+: Slan-, y posterior a los estímulos con LPS y cuerpos apoptóticos de K562, se observó una respuesta diferencial entre estímulos, siendo dependientes del aumento de la proporción de Slan+ tanto en los ensayos de reconstitución como de proliferación. En los ensayos de reconstitución con LPS, en la fracción Slan+, pero no en la Slan-, se observó un aumento de la mediana de fluoresencia de los marcadores de superficie relacionados con activación y maduración. En presencia de cuerpos apopóticos (AB, por sus siglas en inglés Apoptotic Bodies) la fracción Slan+ tuvo una caída de los marcadores de superficie relacionados con maduración en comparación con las células sin estímulo. Por su parte, en la fracción Slan- se observó un aumento en algunos marcadores de maduración y un aumento de la mediana de fluorescencia cuando se estimuló con AB. Las citocinas nos permitieron evaluar las posibles respuestas, en donde se observó que sin estimulo todas las citocinas aumentaron, mientras que con LPS hubo una disminución de IL-10, con AB la IL-10 aumenta y se presenta una caída del IL-6 e IL-1. En los ensayos de proliferación para linfocitos CD4 y CD8, se hubo una regulación negativa sobre la división celular al aumentar la proporción de Slan+ tanto con y como sin PHA-L. Además, se matizó la disminución en presencia de cuerpos apoptóticos (AB). Conclusiones: La capacidad de modular la respuesta a estos estímulos, así como la interacción con otros componentes del sistema, resalta la relevancia que los monocitos Slan+ tienen en la regulación de las respuestas inmunitaria y evidencia que más que comprometidos con la respuesta inflamatoria, su respuesta está condicionada por el estímulo, evidenciando, adicionalmente, su elevada plasticidad.

ABSTRACT: Introduction: Monocytes are cells derived from bone marrow that circulate in the blood and have high plasticity with the ability to differentiate into macrophages or dendritic cells, which is why they are morphologically and functionally heterogeneous. They participate in and regulate processes of innate and adaptive immune responses. Conventionally, three different populations have been defined based on the expression of CD14 and CD16, classical, non- classical, and intermediate monocytes. Non-classical monocytes have an additional heterogeneity, a subpopulation that expresses a modification of the P- selectin glycoprotein 1 (PSGL-1) to which a structured sugar called 6-sulfo- LacNAc binds, this monocyte subpopulation has constituted the population of Slan+ monocytes, which has been associated with the development of inflammatory processes, mainly. Our group previously reported on the ability of non-classical cells to regulate T lymphocyte activation in healthy individuals and their dysfunction in patients with systemic lupus erythematosus. Additionally, it has been reported that they can modulate other cell populations, depending on the stimulus and the proportion in which they are found, which could modulate different responses to CD16+Slan- subpopulations. Therefore, we propose to evaluate the in vitro response through cultures in which CD16+Slan+ monocytes and CD14+CD16- monocytes are reconstituted in defined proportions and are independently exposed to contrasting stimuli such as LPS and apoptotic bodies to assess the response. Influence of this subpopulation on the response of reconstituted monocytes and CD3+ T lymphocytes in co-cultures of monocytes and the presence of apoptotic bodies. Methodology: From 60 mL of peripheral blood, Slan+, and Slan- monocytes were isolated by electromagnetic separation with a hydrodynamic focus. Slan- cells were labeled with CSFE and reconstituted in culture with Slan+ cells at different ratios (Slan+:Slan-; 0:100,000, 10,000:90,000, 40,000:60,000). Cultures were stimulated with LPS and apoptotic bodies from the K562 line. After 48 hours of culture, the expression of HLA-DR, CCR5, CD68, and CD69 was evaluated. Using flow cytometry, proliferation was assessed by CFSE dilution in CD3+ T lymphocytes and added to co-cultures reconstituted with Slan+ and Slan- cells. These were stimulated with PHA-L and apoptotic bodies. The division percentage of CD4 and CD8 lymphocytes was evaluated after 120 hours. Using Lúminex, the concentration of cytokines TNF-α, IL-6, IL-12, IL-10, IL-23, IL-1β, and MCP-1 accumulated in the reconstitution assays was evaluated; and the cytokines IL-2, INF-γ, IL-13, IL-10, and IL-17, accumulated in proliferation assays. Results: After the co-cultivation with different proportions of Slan+: Slan- monocytes, and after the stimuli with LPS and K562 apoptotic bodies, a differential response was observed between stimuli, being dependent on the increase in the proportion of Slan+ both in the assays of reconstitution and proliferation. In the reconstitution assays with LPS, in the Slan+ fraction, but not in the Slan-, an increase in the median fluorescence of surface markers related to activation and maturation was observed. In the presence of AB, the Slan+ fraction had a drop in maturation-related surface markers compared to cells without stimulus. On the other hand, in the Slan- fraction an increase was observed in some maturation markers and an increase in the median fluorescence when stimulated with AB. The cytokines allowed us to evaluate the possible responses, where it was observed that without stimulation all cytokines increased, while with LPS there was a decrease in IL-10, with AB IL-10 increases and there is a drop in il-6 and IL-1. In the proliferation assays of CD4 and CD8 lymphocytes, there was a negative regulation of cell division by increasing the proportion of Slan+ both with and without PHA-L. In addition, the decrease in the presence of AB was qualified. Conclusions: The ability to modulate the response to these stimuli, as well as the interaction with other components of the system, highlights the relevance that Slan+ monocytes have in the regulation of immune responses and pieces of evidence that more than compromised with the inflammatory response, their response it is conditioned by the stimulus, further evidencing its high plasticity.