Evaluación de inhibidores putativos de los transportadores de membrana de la familia MmpL de Mycobacterium tuberculosis como agentes antimicrobianos con potencial terapéutico

Abstract

RESUMEN: La tuberculosis (TB) es una enfermedad infectocontagiosa causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Globalmente en 2021, provocó 10 millones de contagios y se ubica como decimotercera causa principal de muerte y la segunda causa de muerte infecciosa después de la COVID-19. La terapia de fármacos para tratar esta enfermedad es eficaz en el 85% de los casos, pero con el aumento global y específicamente en Colombia de la TB farmacorresistente en el 2021 de 24,64% con respecto al 2020 se evidencia la necesidad de nuevas estrategias farmacológicas sustitutas o que potencialicen los medicamentos existentes. Las proteinas de membrana micobacteriana larga (MmpL) son primordiales para supervivencia de Mtb y son críticos en la síntesis de pared y activos durante el estrés generado dentro del hospedero interfiriendo en la eficacia de los mecanismos inmunitarios. MmpL3 y MmpL11 son esenciales para la supervivencia de la micobacteria y participan en el transporte de diferentes componentes para la formación de la envoltura micobacteriana. Mediante análisis previos de acoplamiento molecular (“docking in sílico”) se seleccionaron compuestos de segundo uso capaces de unir a los dominios periplásmicos de MmpL: se identificaron ocho moléculas capaces de unirse a estas proteínas y con los cuales se desarrolló el presente proyecto. El objetivo fue seleccionar moléculas dentro de este grupo capaces de inhibir la replicación intracelular de Mtb H37Rv en macrófagos murinos B10R. Para este propósito, y mediante citometría de flujo, se seleccionaron concentraciones con mínimos efectos en la función mitocondrial, el daño en la membrana celular (PI), que no indujesen exposición de fosfatidilserina (PS), fragmentación extensiva del DNA o detención del ciclo celular. A estas concentraciones las designamos como las “concentraciones no citotóxicas” y fueron probadas por su capacidad de inhibir el crecimiento las micobacterias ante la exposición directa a los compuestos. Con estas mismas concentraciones se trataron los macrófagos infectados con Mtb H37Rv (MOI 5:1) y a las 48 y 72 h se colectaron los sobrenadantes para la medición de citoquinas, se evaluaron los parámetros de muerte descritos anteriormente y se evaluó en los lisados de macrófagos el número de UFC. Dos de los compuestos, Ácido Glicirricico (GA) y Rifamicina (R), inhibieron de manera significativa el crecimiento directo de Mtb H37Rv en los dos tiempos evaluados similar a Rifampicina (RP) que se utilizó como control positivo. Los efectos fueron mayores a las 72 h en el ambiente intracelular indicando que además de la acción de estas moléculas, los mecanismos efectores de los macrófagos estaban activos. Los resultados sugieren que los fármacos podrían contribuir al control de la Mtb sin comprometer las funciones efectoras de los macrófagos. Según el análisis de componentes principales la acumulación de IL-12 y la función mitocondrial se asociaron con el control de Mtb, pero no la exposición de la PS, IL-10 y la fragmentación extensiva del DNA y el daño en la membrana se asociaron con condiciones permisivas para la replicación micobacteriana. Nuestros resultados abren la puerta para evaluar algunos de los compuestos de segundo uso en ensayos in vivo y de hacer predicciones de unión putativa con las proteínas MmpL3 y MmpL11 con los compuestos que lograron inhibir en el modelo in vitro.

ABSTRACT: Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Globally in 2021, it caused 10 million infections and ranks as the 13th leading cause of death and the second leading cause of infectious death after COVID-19. Drug therapy to treat this disease is effective in 85% of cases, but with the global increase and specifically in Colombia of drug-resistant TB in 2021 of 24.64% compared to 2020, the need for new strategies is evident. pharmacological substitutes or that potentiate the existing medicines. Mycobacterial Membrane Transporters (MmpL) are essential for Mtb survival, critical in cell wall synthesis, and active during stress generated within the host. Mmpls may interfere with the efficacy of immune mechanisms. MmpL3 and MmpL11 are essential for mycobacterial survival and participate in the transport of different components for the formation of the mycobacterial envelope. Based on previous molecular docking analyses (“docking in silico”), eight second-use molecules putatively able to bind to the periplasmic domains of MmpL were selected. The purpose of this study was to select molecules within this group capable of inhibiting the intracellular replication of Mtb H37Rv in B10R murine macrophages. First of all, by flow cytometry, concentrations with minimal effects on mitochondrial function, and cell membrane damage (PI) were selected, which did not induce phosphatidylserine (PS) exposure, extensive DNA fragmentation, or cycle arrest. We designated these concentrations as "non-cytotoxic concentrations" and they were tested for their ability to inhibit the growth of mycobacteria upon direct exposure to the compounds. With these concentrations, the macrophages infected with Mtb H37Rv (MOI 5:1) were treated. At 48 and 72 h, the supernatants were collected to measure cytokines, the death parameters described above were evaluated, and the macrophage lysates were evaluated. the UFC numbers. Two of the compounds, Glycyrrhizic acid (GA) and Rifamicin (R), significantly inhibited the direct growth of Mtb H37Rv at both times, similar to Rifampicin (RP) that was used as a positive control. The effects were greater at 72 h in the intracellular environment, indicating that in addition to the action of these molecules, the effector mechanisms of macrophages were active. The results suggest showed that drugs might contribute to the control Mtb without compromising macrophage effector functions. Based on principal component analysis, IL-12 accumulation, and mitochondrial function were associated with Mtb control, but phosphatidylserine exposure, IL-10, and extensive DNA fragmentation and membrane damage were associated with permissive conditions for mycobacterial replication. Our results open a way to study second-use compounds in vivo assays and to make predictions of putative binding with the MmpL3 and MmpL11 proteins with the compounds that were able to inhibit in the in vitro model.