Estudio del efecto de la fuente de carbono sobre la producción de L-valina en Escherichia coli mediante estrategias de ingeniería metabólica de sistemas

Abstract

RESUMEN: En los últimos años, el lactosuero ha despertado un gran interés como subproducto agroindustrial en los procesos de fermentación microbiana. Debido a su bajo costo y su alta concentración de nutrientes, especialmente la lactosa como fuente principal de carbono, se ha convertido en un objeto de investigación para obtener diversos bio-productos. Sin embargo, el conocimiento sobre el efecto de la lactosa en el metabolismo bacteriano y su capacidad para producir metabolitos esenciales, como los aminoácidos, específicamente la L-valina, es limitado. Por lo tanto, se requieren estudios que utilicen enfoques de ingeniería metabólica de sistemas para comprender mejor el metabolismo de la lactosa y contribuir a la mejora de la producción. En este contexto, se realizó un estudio para evaluar el impacto de diferentes fuentes de carbono (glucosa, lactosa y lactosuero) en la producción de L-valina utilizando Escherichia coli mediante enfoques de ingeniería metabólica y genética. Para ello, se emplearon metodologías de ajuste de modelos de cinéticas de fermentación con las diferentes fuentes de carbono, lo que permitió identificar parámetros cinéticos relevantes. Además, se realizaron análisis de flujo metabólico, variabilidad de flujos, robustez y muestreo de Monte Carlo para comprender en detalle cómo las diferentes fuentes de carbono afectan el metabolismo de E. coli. Basándose en los resultados obtenidos in silico, se diseñó una plataforma que combinó estrategias de deleción y sobreexpresión génica mediante biología sintética de vanguardia con el objetivo de maximizar la producción de 2-cetoisovalerato (2-KIV), precursor clave en la producción de L-valina. Los resultados demostraron que el lactosuero beneficia la biosíntesis de L-valina (36% superior) con respecto a la glucosa y lactosa puras. Posteriormente se aplicaron conceptos de ingeniería metabólica como son el análisis de balance de flujos con los sustratos puros (glucosa y lactosa), donde se evidenció que la lactosa desencadena un mejor flujo de carbono por simultaneo consumo de glucosa y galactosa al hidrolizarse en el citoplasma, proporcionando máxima velocidad específica de crecimiento (0.82 h-1), unas producciones de moles de ATP, NADH, y NADHP por mol de lactosa de 55.3, 22.1 y 20.7, respectivamente. En efecto, gracias a los resultados in silico, se construyó una plataforma de E. coli W, donde primero fueron delecionados los genes mdh y aceF y posteriormente se sobreexpresaron los genes alsS, ilvC e ilvD para confirmar los supuestos generados en los análisis de flujo metabólico y lograr obtener titulaciones de 3.22 g 2-KIV/L y 1.39 g L-valina/L al emplear lactosuero como fuente de carbono, con el más alto rendimiento encontrado por sutrato en la producción de 2-KIV (0.81 g/g sustrato), destacando en rendimientos previamente reportados en la literatura y superando los desafíos asociados con la inhibición por producto y transporte en la producción de L-valina por fermentación. En resumen, este estudio destaca el potencial del lactosuero como materia prima altamente beneficiosa en medios de cultivo para la producción de L-valina y otros bioproductos. La aplicación de enfoques de ingeniería metabólica y genética no solo ha profundizado nuestra comprensión del metabolismo de la lactosa, sino que también ha permitido la creación de cepas mejoradas de E. coli W.

ABSTRACT: In recent years, whey has garnered significant interest as an agro-industrial byproduct in microbial fermentation processes. Due to its low cost and high nutrient concentration, particularly as a carbon source rich in lactose, it has become a subject of investigation for obtaining diverse bio-products. However, knowledge regarding the effect of lactose on bacterial metabolism and its capacity to produce essential metabolites, such as amino acids, specifically L-valine, is limited. Therefore, studies utilizing systems metabolic engineering approaches are required to gain a better understanding of lactose metabolism and contribute to production improvement. In this context, a study was conducted to evaluate the impact of different carbon sources (glucose, lactose, and whey) on L-valine production using Escherichia coli through metabolic and genetic engineering approaches. Kinetic fermentation models were employed, adjusting them with the various carbon sources to identify relevant kinetic parameters. Additionally, metabolic flux analysis, flux variability analysis, robustness analysis, and Monte Carlo sampling were performed to gain detailed insights into how different carbon sources affect E. coli metabolism. Based on the in silico results obtained, a platform was designed that combined gene deletion and overexpression strategies using cutting-edge synthetic biology to maximize the production of 2-ketoisovalerate (2-KIV), a key precursor in L-valine production. The results demonstrated that whey significantly enhanced L-valine biosynthesis (36% higher) compared to pure glucose and lactose. Furthermore, concepts of metabolic engineering were applied, such as flux balance analysis with pure substrates (glucose and lactose), revealing that lactose triggers a superior carbon flux by simultaneous consumption of glucose and galactose upon hydrolysis in the cytoplasm, providing maximum specific growth rate (0.82 h-1), and yields of ATP, NADH, and NADPH per mole of lactose of 55.3, 22.1, and 20.7, respectively. Indeed, based on the in silico results, a platform of E. coli W was constructed, where mdh and aceF genes were first deleted and subsequently alsS, ilvC, and ilvD genes were overexpressed to confirm the assumptions generated in the metabolic flux analysis. This led to achieving titers of 3.22 g 2-KIV/L and 1.39 g L-valine/L using whey as the carbon source, with the highest substrate-to-product yield of 0.81 g/g for 2-KIV, surpassing previously reported yields in the literature and overcoming challenges associated with product inhibition and transport in L-valine fermentation. In summary, this study highlights the potential of whey as a highly beneficial raw material in culture media for the production of L-valine and other bio-products. The application of metabolic and genetic engineering approaches has not only deepened our understanding of lactose metabolism but also enabled the creation of enhanced strains of E. coli W.