Cinética de producción de H2O2 en embriones bovinos producidos in vitro y su efecto sobre actividad mitocondrial

Abstract

RESUMEN: Objetivos: Determinar la cinética de producción de H2O2 y de alteración en la función mitocondrial durante el desarrollo temprano en embriones bovinos producidos in vitro (ebpiv) con alto y bajo potencial de desarrollo. Metodología: De acuerdo a su potencial de alcanzar el desarrollo hasta el estado de blastocito, ebpiv que completaron su primer ciclo celular antes de 32 horas post inseminación (hpi) fueron clasificados como competentes, mientras que aquellos que no lo habían hecho, se clasificaron como no competentes. Para cada grupo, se tomaron un mínimo de 20 embriones para cada tiempo de estudio: 32, 40, 50, 72 y 100 hpi para las pruebas de cinética de H2O2 y función mitocondrial. Los embriones fueron incubados con Dihidrorodamina 123 (DHR) (1∝M) por 15 minutos, y con JC-1 (5∝M) por 30 minutos. Una vez incubados los embriones con sus respectivos fluorocromos, fueron lavados de 3 a 5 veces en PBS para ser evaluados directamente al microscopio de epifluorescencia utilizando los filtros específicos para cada uno. Los embriones fluorescentes (verde) para DHR fueron considerados como positivos para niveles elevados de H2O2. La funcionalidad mitocondrial se determinó por las áreas de fluorescencia roja. Cada prueba se realizó durante tres cohortes diferentes, para un total de 362 embriones competentes y 345 no competentes evaluados para DHR y 292 embriones competentes y 312 no competentes evaluados para JC-1. Los datos (promedio +/- D.E) entre los diferentes puntos de corte (32,40,50,72 y 100 hpi) y entre los grupos (competentes y no competentes) se analizaron mediante ANOVA. Resultados: Se observó un aumento progresivo en la frecuencia de eventos positivos a DHR a partir de las 32 hpi, y al parecer su disminución tiene que ver más con el estado de desarrollo que con el tiempo de cultivo. Aunque esta tendencia se presenta en ambos grupos, se encuentran diferencias significativas (p<0.01) en los valores observados entre el grupo competente y no-competente para cada tiempo de estudio, siendo mayor el número de eventos positivos en éste último grupo. No se encontraron diferencias significativas entre los tiempos de observación ni entre grupos en cuanto a función mitocondrial de ebpiv, pero esta funcionalidad se encontró muy deprimida durante el desarrollo temprano. Conclusiones: La mayor proporción de embriones no competentes que presentan elevación en los niveles de H2O2, podría estar relacionada con el bloqueo en el ciclo celular observado en condiciones in vitro y por ende, con la menor proporción de éstos que alcanzan el estado de blastocito a los 7 días de cultivo. Dichas elevaciones en los niveles de H2O2 no parecen relacionarse con la actividad mitocondrial, ni ésta con la generación del H2O2. De otro lado, la actividad mitocondrial no parece ser un factor de competencia para superar la detención en el ciclo celular. Esta depresión en la función mitocondrial estaría relacionada con algunos arreglos metabólicos observados por otros investigadores. Las fermentaciones en estado sólido han sido utilizadas ampliamente en el reciclaje de materiales voluminosos a través de tecnologías sencillas, con la que se logran incrementar los valores proteicos, mejorando el balance de aminoácidos y la digestibilidad de las materias primas empleadas (Matho et al. 1992; Pedroza et al. 1995 y Rodríguez et al. 2001a). No obstante los conocimientos benéficos que hoy se logran en Cuba con estas tecnologías, aún están limitados a un número reducido de sustrato.

ABSTRACT: Objective: The aim of this research was to determine the kinetic of H2O2 production and inner mitochondrial membrane potential during early development of in vitro produced bovine embryos (ivpbe) with high and low developmental potential. Methodology: According to the potential to reach blastocyst stage, ivpbe were grouped as follows: Those that reach the two cell stage at 32 hours post-insemination (hpi) were considered competent, while those that did not, where considered noncompetent. Embryos were taken from each group 32, 40, 50, 72 and 100 hpi in order to be evaluated for H2O2 and inner mitochondrial membrane potential by epifluorescence. Half of the embryos in each pool were incubated with dihydrorhodamine 123 (DHR) (1μM) for 15 minutes, while the other half were stained with JC-1 (5μM) for 30 minutes before direct observation through epifluorescent microscopy. Green fluorescent embryos after DHR staining were assumed to be positive for H2O2. Inner mitochondrial membrane potential were determined by red fluorescent dots. The data were analyzed (average +/-S.D.) between pools (32,40,50,72 and 100 hpi), and between groups (competent vs. noncompetent), by ANOVA. Results: A progressive increase on H2O2 positive embryos was observed from 32 hpi. Although this tendency was maintained among both groups, there was a significant difference (p<0.01) between the number of positive events in each group: the number of H2O2 positive embryos was greater in the non-competent group at each observation time. There was not significant difference between groups nor between pools on inner mitochondrial membrane potential, but great proportion of mitochondrial clusters showed depolarization in early embryos. Conclusions: The large number of non-competent embryos showing high H2O2 levels, maybe related with the cell cycle arrest observed under culture conditions on ivpbe, and it is consistent with poor blastocyst production in delayed embryos. Increase production of H2O2 does not seem to be related to mitochondrial depolarization, and additionally mitochondrial depolarization does not seem to be a factor involved in the cell cycle arrest. Other investigators have previously reported metabolic rearrangements which may be compatible with the low mitochondrial function observed by us.