Efecto del IFNy en la inducción de trampas extracelulares de los neutrófilos (NET) en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica

Abstract

RESUMEN: Introducción. Las trampas extracelulares de los neutrófilos (NET) son estructuras compuestas principalmente por cromatina y contenido de los gránulos citoplasmáticos, son liberadas por los polimorfonucleares neutrófilos (PMNN) como mecanismo de defensa inmovilizando y destruyendo microorganismos. El proceso mediante el cual estas estructuras son liberadas es conocido como NETosis. Aunque los mecanismos moleculares involucrados en la formación de NET aún no son completamente conocidos se sabe que las especies reactivas del oxígeno (ROS), producidas por el sistema NADPH oxidasa en las células fagocíticas, son esenciales para la descondensación de la cromatina y subsecuente formación de las NET.

La Enfermedad Granulomatosa Crónica (EGC) en una inmunodeficiencia primaria caracterizada por una falla en la producción de ROS como consecuencia de mutaciones en los genes que codifican para las proteínas que hacen parte del sistema NADPH oxidasa en las células fagocíticas. Se ha reportado que los pacientes con EGC no producen NET y la falla en este mecanismo podría ser parcialmente responsable del incremento en la susceptibilidad a infecciones. Se ha reportado que el uso de interferón gamma recombinante (IFN) reduce la susceptibilidad a infecciones en algunos de estos pacientes incrementando parcialmente la actividad oxidativa del sistema NADPH oxidasa y consecuentemente la actividad microbicida de los PMNN. Sin embargo, el mecanismo molecular mediante el cual el IFN promueve la actividad microbicida en los PMNN de los pacientes aun no es conocido. Con base en lo anterior nuestro objetivo fue determinar el efecto del IFN en la producción de NET por parte de los PMNN de pacientes con EGC

Materiales y métodos. Para evaluar la producción de ROS y NET, se aislaron PMNN de individuos sanos (controles) y de pacientes con EGC a partir de sangre periférica, mediante separación por gradiente de densidad. Las células fueron pre-estimuladas con IFN (100 UI/mL) por 2 horas a 37°C y posteriormente activadas con PMA (50 nM) por 15 min a 37°C, la producción de ROS fue medida a través de citometría de flujo

usando el test de oxidación de la dihidrorodamina (DHR). Adicionalmente, para la visualización de las NET, los PMNN fueron pre-estimulados con IFN (100 UI/mL o 250 UI/mL) y estimuladas con PMA (50 nM), ionomicina (5 μg/mL) o LPS (5 μg/mL). Las NET fueron documentadas mediante el uso de un microscopio invertido de fluorescencia, el ADN fue teñido con Hoeschst 33342 y se marcó la elastasa con anticuerpos anti-elastasa humana. La liberación de ADN fue medida a través de un fluorómetro. La producción de NET fue analizada mediante el test de Wilcoxon teniendo en cuenta una p<0.01.

Resultados. Inicialmente los PMNN de individuos sanos y pacientes con EGC fueron estimulados solamente con IFN y se observó que ésta citoquina por sí sola no induce producción de ROS; sin embargo, cuando los PMNN fueron pre-estimulados con IFN y posteriormente estimulados con PMA hubo un incremento en la producción de ROS en comparación con la células que solo fueron estimuladas con PMA. Además, determinamos la producción de NET a través de microscopía de fluorescencia en PMNN de individuos sanos y pacientes tratados con diferentes estímulos. En las células sin estímulo de ambos grupos se observó la morfología clásica de los PMNN con su núcleo multilobulado, sin embargo cuando las células de los individuos sanos fueron estimuladas con PMA, se observó un incremento significativo en la producción de NET, contrario a lo que ocurrió en los PMNN de los pacientes con EGC en donde se detectó una baja producción de NET. Sin embargo, cuando las células de los pacientes fueron pre-estimuladas con IFN 100 UI/mL o IFN 250 UI/mL y posteriormente estimuladas con PMA 50 nM hubo un leve incremento en la producción de NET. La estimulación con ionomicina 5 μg/mL o LPS 5 μg/mL en las células de pacientes y controles resultó en una alta producción de NET lo cual se evidenció a través de microscopía de fluorescencia y la cuantificación por la fluorometría.

Discusión. En el presente estudio se demostró que la producción de ROS y NET en PMNN de individuos sanos es inducida normalmente después de la estimulación con PMA, pero no cuando las células son estimuladas solamente con IFN. Además la pre- estimulación con IFN seguido de la estimulación con PMA incrementa la producción

de ROS. Interesantemente, se observó que las células de los pacientes liberan NET cuando son estimuladas con PMA, ionomicina y LPS, contrario a lo que se ha reportado en la literatura. También, estos resultados sugieren que el IFN podría estar potenciando la actividad microbicida de los PMNN induciendo una mayor liberación de NET. La alta producción de NET cuando las células fueron estimuladas con ionomicina está relacionada con un mecanismo independiente del oxígeno. Finalmente, la producción de NET en células estimuladas con LPS indica que tal vez los PMNN podrían responder frente algunas bacterias a través de la NETosis

ABSTRACT: Introduction. Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are complex variable structures comprised mainly of chromatin and proteins from intracytoplasmic granules that are released by Polymorphonuclear Neutrophils (PMNs) as a defense mechanism that immobilize microorganisms to facilitate their destruction. The process by which these structures are released is known as NETosis. Although the molecular events involved in the formation of NETs are not completely understood, it is known that reactive oxygen species (ROS) produced by the NADPH oxidase system by these phagocytic cells are essential for chromatin decondensation and subsequently NETs formation.

Chronic Granulomatous Disease (CGD) is a primary immunodeficiency characterized by a failure to produce ROS due to mutations in genes coding for different proteins associated with the NADPH oxidase system in phagocytic cells. It has been previously shown that CGD patients do not release NETs and it has been suggested that this mechanism might be partly responsible for their increased susceptibility to infections. The use of recombinant human Interferon gamma (IFN) has been shown to reduce this susceptibility in some patients by partly increasing NADPH oxidase activity and consequently the microbicidal activity of PMNs. However, the molecular mechanism by which IFN promotes most of its microbicidal activity in PMNs of these patients remains unclear. Therefore, we aimed to determine whether IFN affects the production of NETs in PMNs from CGD patients.

Methods. To evaluate production of ROS and NETs, human PMNs were isolated from healthy individuals and patients with X-CGD from peripheral blood using density gradient separation. The cells were then primed with 100 UI/mL of IFN for 2 hours at 37oC, and subsequently stimulated with a 50 nM solution of PMA for 15 min at 37°C. ROS production was measured by flow cytometry using the dihydrorhodamine oxidation test (DHR). In addition, for visualization of NETs, PMNs were primed with IFN (100 UI/mL or 250 UI/mL) and stimulated with PMA (50 nM) or Ionomycin (5 μg/mL) or LPS

(5 μg/mL). NETs formation was documented with the Hoeschst 33342 stain solution for DNA and anti-human elastase antibodies, using an inverted fluorescent microscope. DNA release was measured by a fluorometer. NETs production was analyzed by Wilcoxon test with p<0.01.

Results. Initially, PMNs from healthy individuals and patients were stimulated with IFN 100 UI/mL alone, and no measurable production of ROS by DHR testing was observed. However, stimulation of PMNs of both groups with PMA 50 nM resulted in high production of ROS as expected. Furthermore, when PMNs were primed with IFN and subsequently stimulated with PMA it was observed an increase in the induction of ROS when compared with PMNs stimulated with PMA only. Next, we used fluorescence microscopy to visualize NETs under different conditions. Thus, PMNs from both groups that were non-stimulated retained the classic morphology of multilobed nuclei; in contrast, PMNs from healthy individuals that were stimulated with PMA showed a significant production of NET whereas PMNs from X-CGD patients showed low formation of these structures. In addition, PMNs from both groups treated with ionomycin or LPS resulted in high production of NETs as evidenced by fluorescence microscopy and fluorometry.

Discussion. Herein we demonstrate that production of ROS and NETs by PMNs is induced normally in healthy individuals by stimulation with PMA but not by IFN alone, besides priming with IFN followed by PMA stimulation increased the ROS production. Interestingly, we found that PMNs from CDG patients released NETs when stimulated with PMA, ionomicyn and LPS, in contrast to previous reports. Therefore, we suggest that IFN could be potentiating the microbicidal activity of PMNs by promoting the production of NETs. The high production of NETs when cells were stimulated whit ionomicyn was associated with an independent ROS NETs release. Finally, Production of NETs when cells were stimulated with LPS indicates that PMNs could response against some bacteria through a NETosis mechanism.