Producción de trampas extracelulares de neutrófilos (net) y su efecto frente a paracoccidioides brasiliensis

Abstract

RESUMEN: El hongo Paracoccidioides brasiliensis es el agente causal de la paracoccidioidomicosis (PCM), una micosis sistémica y endémica restringida a ciertas regiones de América Latina, incluyendo Colombia. En estudios experimentales se ha observado que los Polimorfonucleares neutrófilos (PMN) juegan un papel importante como células efectoras e inmunomoduladoras en los estadios tempranos de la infección por P. brasiliensis, contribuyendo a la resistencia del hospedero. Recientemente se describió una nueva estrategia microbicida por los PMN: las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). Estas consisten en la liberación de DNA nuclear con un alto contenido de histonas y proteasas, y están implicadas en la supervivencia o eliminación de diferentes microorganismos como los hongos Aspergillus spp. y Candida albicans. En el presente estudio se demostró, mediante microscopía de fluorescencia, la producción de NETs frente a conidias y levaduras de P. brasiliensis. La producción de NETs se confirmó mediante la cuantificación de DNA por espectrofluorometría, donde se observó que las conidias y levaduras de P. brasiliensis presentaban niveles extracelulares de DNA equiparables a los PMN tratados con Lipopolisacarido (LPS) o infectados con levaduras de C. albicans. El tratamiento con DNasa mostró una disminución significativa de la fluorescencia, lo que comprobó que el DNA cuantificado era extracelular. Cuando se usó el inhibidor de la NADPH oxidasa [Diphenyleneiodonium (DPI)] se observó una inhibición parcial en la producción de NETs frente a las levaduras de P. brasiliensis; por el contrario, este inhibidor no afectó la producción de estas estructuras inducidas por las conidias del hongo, lo cual parece indicar que el mecanismo de producción de NETs frente a P. brasiliensis se presenta a través de mecanismos dependientes e independientes de especies reactivas de oxígeno (ROS). Por otro lado, cuando se trataron los PMN con citocalasina D o interferon gamma (IFN-γ) recombinante, no se observaron diferencias en la producción de NET frente al hongo, sugiriendo que la fagocitosis o esta citoquina parecen no estar involucradas en este proceso. Adicionalmente, cuando se utilizó una cepa mutante de P. brasiliensis con una expresión disminuida del gen que codifica para una oxidasa alternativa [(AOX), enzima que participa en los procesos oxidativos], se observó que las levaduras de la cepa mutante indujeron un mayor nivel de NETs en comparación con la cepa silvestre o las levaduras que portaban el vector vacío. Finalmente, la cuantificación de Unidades formadoras de colonias (UFC) no mostraron diferencias significativas cuando los PMN fueron tratados con diferentes inhibidores de los procesos relacionados con la producción de NETs (DPI, DNasa o Citoclasina-D). Este es el primer estudio en el cual se demuestra que los diferentes morfotipos de P. brasiliensis (conidias y levaduras) inducen la formación de NETs; sin embargo, los resultados sugieren que este mecanismo de defensa parece ser inducido por mecanismos dependientes e independientes de ROS de acuerdo al morfotipo utilizado, de igual manera este mecanismo parece no ser efectivo en la eliminación del hongo, sin embargo podría ejercer un efecto fungiestático. Adicionalmente, la modulación de la producción de las NETs por P. brasiliensis podría estar relacionada con la virulencia del hongo