Perfiles Transcripcionales y Funcionales Asociados con Rechazo y Aceptación del Injerto a Largo Plazo en Pacientes Trasplantados de Riñón

Abstract

RESUMEN: El trasplante renal constituye la terapia de remplazo de elección para pacientes con enfermedad crónica terminal y se considera superior a la diálisis por aspectos como mejoramiento de la calidad de vida del paciente y mayor probabilidad de supervivencia. El trasplante representa un reto inmunológico considerable para el paciente, ya que el injerto inflamado por cuenta de los mediadores liberados en la remoción del órgano, la lesión por isquemia/reperfusión y el daño mecánico generado en los procesos quirúrgicos, es una fuente de aloantígenos que promueve la activación de la respuesta inmune del paciente con la posterior instauración de una respuesta adaptativa por las vías de alorreconocimiento directo, indirecto y semidirecto. Aunque estos mecanismos inmunológicos están bien establecidos y se sabe que son los responsables del desarrollo de rechazo, y al mismo tiempo pueden estar asociados a la tolerancia inmunológica, aún no se ha logrado mejorar la supervivencia a largo plazo del injerto, ya que el rechazo crónico sigue siendo la principal limitante para el paciente trasplantado. La alta heterogeneidad genética entre los pacientes, la respuesta a las terapias inmunosupresoras y factores ambientales externos pueden influir en que los pacientes trasplantados presenten perfiles moleculares diferenciales; diferencias que a su vez pueden estar gobernando los mecanismos celulares efectores. En estudios previos ya se han reportado genes diferencialmente expresados en muestras de sangre, orina o biopsia de pacientes trasplantados, mediante metodologías de secuenciación masiva como la secuenciación de RNA y dichos genes se han asociado a procesos inmunes. El objetivo de este trabajo fue explorar diferencias en la expresión génica mediante RNA-Seq en muestras de sangre, biopsia y orina de pacientes trasplantados de riñón con rechazo agudo, rechazo crónico y supervivencia del injerto a largo plazo, así como en pacientes con enfermedad renal crónica sometidos a hemodiálisis. Adicionalmente, de los pacientes en rechazo agudo se realizó un análisis transcripcional posterior al suministro de la terapia anti-rehazo para lo cual fue necesario tomar nuevamente muestras de sangre y orina tres semanas después del tratamiento. De cada muestra se aisló y se secuenció RNA. Los datos se analizaron para identificar genes diferencialmente expresados que pudieran aportar al entendimiento de los mecanismos inmunológicos asociados al desenlace del injerto renal. La elección de estas muestras en conjunto se hizo con base en su relevancia biológica en el trasplante por el contacto estrecho que tienen con tejidos, células y moléculas implicados en la alorrespuesta inmune frente al injerto renal. En cada capítulo se describen las aproximaciones metodológicas empleadas para la exploración de los genes diferencialmente expresados, así como de las categorías funcionales relacionadas. Inicialmente fue necesario estandarizar un protocolo para el aislamiento de ARN de orina. Este fue uno de los pasos con mayor demanda de tiempo debido a que fue necesario probar diferentes metodologías de extracción de RNA idóneo para secuenciación, a partir de orina. El procedimiento no está muy reportado en la literatura y muchos de los métodos actualmente implementados, no generaban un rendimiento adecuado. La extracción se puso a punto implementando Tri Reagent, así como el uso de glicógeno y acetato de sodio. Posterior a todo el proceso de secuenciación y análisis inicial, se identificó la similitud entre biopsia y orina en función del número de genes diferencialmente expresados en pacientes con rechazo agudo y rechazo crónico. En los hallazgos se identificó un alto número de genes regulados en ambas muestras con relación a sangre periférica, la cual se usó como línea de base en el análisis de expresión diferencial. Dentro de los genes inmunes enriquecidos en orina y biopsia se identificaron algunos genes que codifican para quimiocinas, mientras que en sangre se identificaron principalmente receptores de estas moléculas. En los análisis de enriquecimiento se identificaron procesos biológicos que también fueron comunes entre biopsia y orina y que tuvieron una relación importante con mecanismos efectores del rechazo. A continuación, se realizó la exploración únicamente en muestras de sangre periférica. Esta muestra fue la única que se pudo captar de todos los individuos y pacientes incluidos, ya que las muestras de biopsia solo se tomaron de pacientes en rechazo, y las muestras de orina no fue posible tomarlas de pacientes en diálisis y de individuos sanos. El análisis se realizó en dos partes. En la primera se hizo el análisis de expresión diferencial entre pacientes en rechazo, pacientes con supervivencia del injerto a largo plazo y pacientes en hemodiálisis con relación a controles sanos. Después se identificaron los genes comunes entre rechazo y supervivencia del injerto, con los pacientes en diálisis, para identificar genes y procesos biológicos comunes en los pacientes en diálisis que pudieran estar asociados al posterior desenlace del injerto y ser aplicados como una herramienta pronóstica. Uno de los hallazgos más relevantes, fue la identificación de procesos asociados a inflamación compartidos por los pacientes trasplantados y los pacientes en diálisis. En la segunda parte, se realizó el análisis de expresión diferencial entre pacientes con rechazo y pacientes con supervivencia del injerto a largo plazo. Se identificó que en pacientes con supervivencia hay mayor enriquecimiento de genes y procesos implicados en la regulación inmunológica, mientras que en rechazo agudo hubo un enriquecimiento de procesos inflamatorios como quimiotaxis y en rechazo crónico un enriquecimiento de actividad de neutrófilos. Seguidamente, se exploraron diferencias transcripcionales en muestras de orina, ya que como se mencionó previamente, es una muestra de gran relevancia por ser poco invasiva y por la alta probabilidad de contener células y moléculas indicadoras del estado del injerto. Debido al alto número de genes regulados entre los pacientes en rechazo y pacientes son supervivencia del injerto a largo plazo, se realizó un análisis de enriquecimiento a partir de todos los genes, pero también a partir de los 1000 y 2000 genes con mayor nivel de regulación y significancia. En rechazo agudo y crónico con respecto a supervivencia del injerto a largo plazo se identificaron genes asociados a la quimiotaxis, así como enriquecimiento de procesos como presentación antigénica. Finalmente, al realizar un análisis de enriquecimiento celular, se identificó una tendencia al incremento en la fracción de células inmunes en orina de pacientes en rechazo con relación a supervivencia del injerto a largo plazo. Finalmente, en el análisis de expresión diferencial en pacientes con rechazo agudo antes y después de la terapia anti-rechazo, se identificó la supresión de categorías asociadas a la respuesta inflamatoria, a la actividad de citoquinas y a la activación de células TCD4+ en la condición postratamiento. En conjunto, se identificó que en la orina se refleja en un alto porcentaje la regulación de genes y procesos que pueden estar ocurriendo a nivel del tejido renal y que dichos procesos se asocian a los procesos efectores que se activan en rechazo o tolerancia del injerto. Adicionalmente, se identificó que si bien en la sangre hay un nivel de regulación importante de genes que hacen parte de las vías de señalización activadas en rechazo, la orina también representa una fuente de marcadores que se asocian a la respuesta efectora frente al injerto lo cual debe de ser validado en un mayor número de pacientes.

ABSTRACT: Kidney transplantation is the replacement therapy of choice for patients with terminal chronic disease and is considered superior to dialysis for aspects related to quality of life and greater probability of survival. Transplantation represents a considerable immunological challenge for the recipient, as the inflamed graft is a source of alloantigens that promotes the activation of the immune response with the subsequent establishment of an adaptive response through direct, indirect, and semidirect allorecognition pathways. Although these immunological mechanisms are well established and are known to be responsible for the development of rejection or may be associated with immunological tolerance, it has not yet been possible to improve long-term graft survival, since chronic rejection continues to be the leading cause of graft loss. The high heterogeneity between patients, the response to immunosuppressive therapies and external environmental factors may influence that patients with a common diagnosis whether acute or chronic rejection mediated either by T cells or by antibodies, present differential molecular profiles; differences that in turn may be governing the effector cellular mechanisms. In previous studies, differentially expressed genes have already been reported in blood, urine, or biopsy samples of kidney transplant patients, using massive sequencing methodologies such as RNA sequencing, and these genes have been associated with immune processes. The objective of this work was to explore differences in gene expression in kidney transplant patients with acute rejection, chronic rejection, and long-term graft survival, as well as in patients with chronic kidney disease undergoing hemodialysis, based on the analysis of RNA-Seq derived data. For this aim, blood, biopsy and urine samples were jointly implemented, since they have great biological relevance in transplantation due to their close contact with tissues, cells, and molecules involved in the immune alloresponse. In addition, acute rejection was explored both at the time of active rejection, as well as after the administration of anti-rejection immunosuppressive therapy, for which new samples were taken three weeks after treatment. In this way, transcriptional differences that could be associated with the response to drugs were explored. Each chapter describes the methodological approaches used to explore differentially expressed genes, as well as related functional categories. Initially it was necessary to standardize a protocol for the isolation of RNA from urine. This was one of the most time-demanding steps because it was necessary to test different methodologies for extracting RNA suitable for sequencing from urine. The procedure is not widely reported in the literature and many of the currently implemented methods did not generate adequate performance. The extraction was fine-tuned by implementing Tri Reagent, as well as the use of glycogen and sodium acetate. After the entire sequencing process and initial analysis, the similarity between biopsy and urine was identified based on the number of differentially expressed genes in patients with acute rejection and chronic rejection. In the findings, a high number of regulated genes was identified in both samples in relation to peripheral blood, which was used as a baseline in the analysis of differential expression. Within the immune genes enriched in urine and biopsy, some chemokine ligand genes were identified, while in blood, receptors for these molecules were mainly identified. In the enrichment analyzes, biological processes were identified that were also common between biopsy and urine and that had an important relationship with effector mechanisms of rejection. Subsequently, the examination was performed only on peripheral blood samples. This sample was the only one that could be taken from all the individuals and patients included, since biopsy samples were only taken from patients in rejection; urine samples could not be taken from dialysis patients and healthy individuals. The analysis was carried out in two parts. Firstly, differential gene expression analysis was performed in patients in rejection, patients with long-term graft survival, patients on hemodialysis and healthy controls. Common genes between rejection and graft survival were then identified with dialysis patients to identify common genes and biologic processes in dialysis patients that might be associated with engraftment outcomes. One of the most relevant findings was the identification of processes associated with inflammation shared by transplant patients and the dialysis group. Secondly, differential expression analysis was performed between patients with rejection and patients with long-term graft survival. It was identified that in patients with survival there was a greater enrichment of genes and processes involved in immune regulation, while in acute rejection there was an enrichment of inflammatory processes such as chemotaxis and in chronic rejection an enrichment of neutrophil activity. Subsequently, transcriptional differences in urine samples were explored. Due to the high number of regulated genes among rejection patients and patients with long-term graft survival, an enrichment analysis was performed based on the wholes regulated genes, but also on the 1,000 and 2,000 genes with the highest level of regulation and significance. In acute and chronic rejection with respect to long-term graft survival, genes associated with chemotaxis were identified, as well as enrichment of processes such as antigenic presentation. Finally, when performing a cell enrichment analysis, an increasing trend was identified in the fraction of immune cells in the urine of patients in rejection in relation to long-term graft survival. Finally, in the analysis of differential expression in patients with acute rejection before and after antirejection therapy, the suppression of categories associated with the inflammatory response, cytokine activity, and activation of CD4+ T cells was identified in the post-treatment condition. Overall, it was identified that a high percentage of the regulation of genes and processes at the renal tissue level is reflected in the urine and that these processes are associated with the effector processes that are activated in graft rejection or tolerance. Additionally, it was identified that although in the blood there is an important level of regulation of genes that are part of the signaling pathways activated in rejection, urine also represents a source of markers that are associated with the effector response against the graft, which It should be validated in a larger number of patients.