Determinación del efecto tóxico de Parasporinas obtenidas a partir de PS2Aa1 producida por Bacillus thuringiensis, en células de cáncer de colon y leucemia

Abstract

RESUMEN: El Cáncer es la segunda causa de muerte a nivel global con más de 10 millones de defunciones para el 2020. Algunos de los tipos de cáncer más prevalentes a nivel mundial son el colorrectal y leucemia. De estos, para leucemia se informaron 474.519 nuevos casos y 311.594 defunciones para el 2020. Por otra parte, el cáncer colorrectal reportó 1.931.590 nuevos casos y 935.173 muertes alrededor del mundo para este mismo año. Dicho esto, se hace necesaria la investigación de nuevas estrategias y moléculas para el tratamiento de distintos tipos de cáncer sin generar efectos colaterales; entre estas alternativas se encuentran las parasporinas, que son proteínas producidas por Bacillus thuringiensis (Bt). De momento, han sido identificadas diversas parasporinas distribuidas en 6 grupos por el comité de clasificación y nomenclatura de parasporinas. Entre estas, la PS2Aa1 más recientemente denominada como Mpp46Aa1, se destaca ampliamente por exhibir una fuerte actividad citotóxica frente a líneas celulares de leucemia, cáncer de colon, cáncer de pulmón, entre otros; presentando efectos leves o no detectables en células no cancerígenas. La PS2Aa1 es una toxina TFP-β relacionada con la proteína tipo aerolisina. Con base en esto y mediante estudios cristalográficos, se determinó que esta parasporina estaba compuesta por 3 dominios, el dominio uno es el encargado de la interacción inicia con el receptor, mientas que los dominios 2 y 3 tiene la función de oligomerización y formación del poro. Sin embargo, con respecto al mecanismo de acción y su cascada de señalización apoptótica, aún es necesario elucidar diversos aspectos importantes como las moléculas implicadas en la presunta ruta apoptótica desencadenada, así como los receptores clave para la unión de la toxina a la membrana celular diana, su oligomerización y formación del poro, entre ellos, GPI ha sido el receptor más estudiado, mostrando un papel crucial en la actividad de PS2Aa 1, la cual es nula cuando se inhibe la expresión del centro de glicano de GPI en líneas celulares CHO K1. Además, el APN también ha sido considerado como un posible receptor implicado de acuerdo a ensayos realizados en HCT116, en donde no se evidenció actividad tóxica por parte de PS2Aa1 cuando las células fueron expuestas previamente a un inhibidor de APN. En ese orden de ideas, este estudio tiene como objetivo el análisis de variantes mejoradas de la PS2Aa1 para el planteamiento de un modelo de acción más estructurado, así como la obtención de variantes con un posible potencial mejorado en células cancerígenas. Mediante este estudio, se encontró que las variantes 3-35 y N65 presenta un mayor citotoxicidad e índice de selectividad hacia líneas celulares de cáncer de colon (SW480, SW620 y Caco-2) y leucemia (Molt-4 y Jurkat); específicamente , en las líneas SW480 y Molt-4 presentaron indicios de procesos apoptóticos mediante la vía intrínseca al ser tratadas con las variantes 3-35 y N65, generando un incremento (con respecto a la PS2Aa1 nativa) en la activación de caspasas 3/7 y 9, además de generar despolarización de la membrana mitocondrial y exposición de fosfatidilserina en el exterior de la membrana de las células afectadas. Este trabajo permitió establecer que la mutagénesis sitio especifica puede ser utilizada para el mejoramiento genético de la PS2Aa1 cuando las sustituciones son realizadas en puntos críticos para la actividad de la proteína, pues en este caso las variantes 3-35 y N65 resultaron más promisorias que la nativa. Sin embargo, dichas variante mostraron una actividad similar en cuanto a la ruta de muerte celular respecto a la nativa, sugiriendo una ruta apoptótica independiente de estrés oxidativo en SW480 y Molt-4.

ABSTRACT: By 2020, Cancer was the second cause of death with more than 10 million globally. Some of the most prevalent types of cancer worldwide are colorectal and leukemia. Of these, for leukemia, 474.519 new cases and 311.594 deaths are reported for 2020. On the other hand, colorectal cancer reported 1.931.590 new cases and 935.173 deaths around the world for the same year. Making this issue relevant to investigate new strategies and molecules for the treatment of different types of cancer without generating side effects; among these alternatives the parasporins, which are proteins produced by Bacillus thuringiensis (Bt) . At the moment, the parasporins are distributed in 6 groups have been identified by The Parasporin Classification and Nomenclature Committee. Among these, the PS2Aa1 more recently named Mpp46Aa1 stands out for exhibiting strong cytotoxic activity against leukemia, colon cancer, and lung cancer cell lines, among others; presenting slightly or undetectable effects in non-cancer cells. PS2Aa1 is a TFP-β toxin related to aerolysin-like proteins. Based on this and through crystallographic studies, it was established that this parasporin is composed by 3 domains, domain one is in charge of the initial interaction with the receptor, while domains 2 and 3 have the function of oligomerization and pore formation. However, regarding the mechanism of action and its apoptotic signaling cascade, it is still necessary to investigate various important aspects such as involving molecules in the presumed apoptotic pathway, as well as the key receptors for the binding of the protein to the target cell, its oligomerization and pore formation, among those, GPI has been the most studied receptor, showing a crucial role in the PS2Aa 1 activity which is lost when glycan core of GPI is depleted. Additionally, APN receptors have been shown to be crucial in the activity of PS2Aa1 against cancer cells, considered as a possible receptor involved according to tests carried out on HCT116, where no toxic activity was evidenced by PS2Aa1 when the cells were exposed to an APN inhibitor . In this sense, this study aims to analyze improved proteins of PS2Aa1 to propose a more structured model of action, as well as obtain variants with a possible improved potential in cancer cells. Through this study, it was found that the 3-35 and N65 variants presented a higher cytotoxicity and selectivity index towards colon cancer cell lines (SW480, SW620 and Caco-2) and leukemia (Molt-4 and Jurkat); In addition, the SW480 and molt4 lines showed signs of apoptotic processes through the intrinsic pathway when treated with the 3-35 and N65 variants, with an increase (concerning the native PS2Aa1) in the activation of caspases 3/7 and 9, it has been also detected the depolarization of the mitochondrial membrane and the exposure of phosphatidylserine on the outside of the membrane of the affected cells. This work allowed us to establish that site-specific mutagenesis can be used for the genetic improvement of PS2Aa1 when the substitutions are made at critical points for the activity of the protein since in this case the 3-35 and N65 variants were more promising than the native. However, these variants showed a similar activity regardin the cell death pathway as native parasporin, suggesting an apoptotic pathway independent of oxidative stress in SW480 and Molt-4.