La rotenona como modelo de estrés oxidativo y el papel neuroprotector de la curcumina, el tramiprosato y el azul de metileno en neuronas colinérgicas: estrategia multi-target en la enfermedad de Alzheimer

Abstract

RESUMEN: La EA es un trastorno neurodegenerativo, que causa un deterioro cognitivo progresivo e irreversible, y se caracteriza clínicamente por pérdida de la memoria y función ejecutiva, llevando a la demencia en estadios avanzados. Neuro patológicamente, se caracteriza por el depósito intra y extracelular del péptido β-amiloide (Aβ), la formación de ovillos neurofibrilares intracelulares de Tau (NFT), además de disforia y pérdida neuronal, principalmente de las neuronas colinérgicas en el hipocampo. Actualmente es la enfermedad neurodegenerativa con mayor prevalencia a nivel mundial, representando entre el 60% y el 80% de los casos de demencia. El número de afectados oscila entre 50.4 y 65.1 millones, estimándose que la cifra se triplique para el 2050. Su etiología es multifactorial y están implicados simultáneamente varios procesos patológicos como amiloidosis, taupatía, estrés oxidativo (EO), disfunción mitocondrial y neuroinflamación, conduciendo finalmente a la muerte neuronal.

A pesar de los avances en el entendimiento de la etiología de la enfermedad y de los múltiples ensayos clínicos que buscan desarrollar terapias para la EA, hasta ahora no se ha podido determinar con exactitud las causas que conducen a la muerte neuronal, y actualmente no existe un tratamiento que haya logrado revertir o detener la neurodegeneración en estos pacientes. En este sentido es necesaria la búsqueda e investigación de nuevos modelos de estudio de EA y de nuevos posibles compuestos farmacéuticos.

Recientemente se ha reportado la capacidad de la rotenona de inducir vías patológicas observadas en la EA como la hiperfosforilación de Tau, apoptosis, disfunción colinérgica y mitocondrial en modelos murinos. También se ha hallado que productos naturales, entre ellos la curcumina, el tramiprosato y el azul de metileno (MB), intervienen simultáneamente en múltiples vías asociadas con la EA por sus capacidades anti-amiloidogénicas, antiagregantes de Tau, antioxidantes, antiinflamatorias, y quelantes. En estudios in vitro la curcumina y el tramiprosato disminuyen la formación de placas seniles por su interacción con el Aβ, además de tener efectos antioxidantes y antiinflamatorios, mientras que el MB reduce la auto agregación de Tau, la disfunción mitocondrial y el estrés oxidativo.

Dentro de este contexto, el presente proyecto busca evaluar el efecto de la rotenona en la generación de los mecanismos patológicos presentes en la EA como la formación del H2O2, el mantenimiento del ΔΨm, la expresión de marcadores de estrés oxidativo, apoptóticos y de agregación proteica, así como la respuesta funcional a la acetilcolina. Adicionalmente se analizó el efecto de terapias individuales o combinadas de curcumina, tramiprosato y MB en estos mecanismos neuropatológicos, en un modelo neuronal colinérgico con y sin el citotóxico rotenona.

Para determinar estos resultados, se realizaron ensayos de viabilidad MTT y ensayos de inmunofluorescencia (IF) con las sondas Mitotracker, DCF-DA y Fluo 3-AM, para la medición del ΔΨm, formación de H2O2 y entrada intracelular de Ca2+ respectivamente. Así mismo se realizaron IF con anticuerpos para Caspasa 3, p-Tau, DJ1-Ox y P-c-Jun para el análisis de la expresión de marcadores de EO, NFT y apoptosis.

Los resultados obtenidos han mostrado que las CSNC expresan marcadores de linaje colinérgico (VAChT y ChAT) en mayor medida que las CME, evidenciando un proceso de transdiferenciación exitoso. Adicionalmente el cultivo con rotenona indujo el desarrollo de todas las vías patológicas evaluadas, desencadenando un aumento de la formación del H2O2, la oxidación de DJ1, la expresión de caspasa 3 y la fosforilación de Tau y c-Jun, este citotóxico también redujo el ΔΨm, por lo que es un modelo químico adecuado para la inducción de los mecanismos patológicos presentes en la EAE en las CSNC.

Los tratamientos individuales y combinados de curcumina, tramiprosato y MB no afectaron la viabilidad celular a excepción de concentraciones mayores a 1μM de MB que disminuyen la viabilidad de forma dosis dependiente. Las concentraciones de curcumina 1μM, MB 0.5μM y tramiprosato 50 μM + MB 0.25μM disminuyeron la formación de H2O2, este último tratamiento también aumentó el ΔψM.

También Se observó que el tratamiento con tramiprosato a 50 μM disminuyó la expresión del marcador proapoptótico caspasa 3, mientras que las concentraciones de tramiprosato 250 μM y el MB 0.25 μM redujeron la expresión del marcador de agregación proteica p-Tau Ser202/Thr205. Por otro lado, la oxidación de DJ1-Ox-Cys106, la fosforilación de c-Jun y la respuesta a acetilcolina no se modificaron con los tratamientos individuales o combinados.

En las CSNC incubadas simultaneamente con Rotenona 50 μM.y el tratamiento combinado curcumina.1 μM + tramiprosato 50 μM + MB 0.25μM se halló que el tratamiento disminuye la fosforilación de Tau, la expresión de caspasas y la disfunción colinérgica. Por lo que se puede concluir que la rotenona es un buen modelo químico para la simulación de la EAE en modelos neuronales colinergicos in vitro, y que las moléculas curcumina, tramiprosato y MB en terapias individuales o combinadas, presentan resultados promisorios para el tratamiento de pacientes con esta patología.

ABSTRACT: AD is a neurodegenerative disorder, which causes progressive and irreversible cognitive impairment, and is clinically characterized by loss of memory and executive function, leading to dementia in advanced stages. Neuropathologically, it is characterized by intra- and extracellular deposition of β-amyloid (Aβ) peptide, formation of intracellular neurofibrillary tangles of Tau (NFT), in addition to dysphoria and neuronal loss, mainly of cholinergic neurons in the hippocampus. It is currently the most prevalent neurodegenerative disease worldwide, accounting for 60% to 80% of dementia cases. The number of people affected ranges between 50.4 and 65.1 million, and it is estimated that this figure will triple by 2050. Its etiology is multifactorial and several pathological processes are involved simultaneously (amyloidosis, tauopathy, oxidative stress (OS), mitochondrial dysfunction and neuroinflammation, ultimately leading to neuronal death. Despite advances in the understanding of the etiology of the disease and the multiple clinical trials that seek to develop therapies for AD, so far it has not been possible to determine the exact causes that lead to neuronal death, and there is currently no treatment that has managed to reverse or stop neurodegeneration in these patients. In this sense, it is necessary to search for and investigate new models for the study of AD and new possible pharmaceutical compounds. Recently, the ability of rotenone to induce pathological pathways observed in AD such as Tau hyperphosphorylation, apoptosis, cholinergic and mitochondrial dysfunction in murine models has been reported. Natural products, including curcumin, tramiprosate and methylene blue (MB), have also been found to be simultaneously involved in multiple pathways associated with AD through their anti-amyloidogenic, Tau antiaggregating, antioxidant, anti-inflammatory, and chelating abilities. In in vitro studies curcumin and tramiprosate decrease senile plaque formation by their interaction with Aβ, in addition to having antioxidant and anti-inflammatory effects, while MB reduces Tau self-aggregation, mitochondrial dysfunction, and oxidative stress. Within this context, the present project seeks to evaluate the effect of rotenone on the generation of pathological mechanisms present in AD such as H2O2 formation, maintenance of ΔΨm, expression of oxidative stress, apoptotic and protein aggregation markers, as well as functional response to acetylcholine. Additionally, the effect of single or combined therapies of curcumin, tramiprosate and MB on these neuropathological mechanisms was analyzed in a cholinergic neuronal model with and without the cytotoxic drug rotenone. To determine these results, MTT viability assays and immunofluorescence (IF) assays were performed with Mitotracker, DCF-DA and Fluo 3-AM probes, for the measurement of ΔΨm, H2O2 formation and intracellular Ca2+ entry, respectively. Likewise, IF with antibodies for Caspase 3, p-Tau, DJ1-Ox and P-c-Jun were performed for the analysis of the expression of EO, NFT and apoptosis markers. The results obtained have shown that CSNCs express cholinergic lineage markers (VAChT and ChAT) to a greater extent than ESCs, evidencing a successful transdifferentiation process. Additionally, culture with rotenone induced the development of all pathological pathways evaluated, triggering an increase in H2O2 formation, DJ1 oxidation, caspase 3 expression and Tau and c-Jun phosphorylation, this cytotoxicity also reduced ΔΨm, making it a suitable chemical model for the induction of pathological mechanisms present in EAE in CSNCs. Individual and combined treatments of curcumin, tramiprosate and MB did not affect cell viability with the exception of concentrations greater than 1μM of MB which decrease viability in a dose-dependent manner. Concentrations of curcumin 1μM, MB 0.5μM and tramiprosate 50 μM+MB.0.25μM decreased H2O2 formation, the latter treatment also increased the ΔψM.

It was also observed that treatment with tramiprosate at 50 μM decreased the expression of the proapoptotic marker caspase 3, whereas concentrations of tramiprosate 250 μM and MB 0.25μM reduced the expression of the protein aggregation marker p-Tau.Ser202/Thr205. On the other hand, DJ1-Ox-Cys106 oxidation, c-Jun phosphorylation and response to acetylcholine were not modified by single or combined treatments. In CSNCs incubated simultaneously with Rotenone 50 μM.and the combined treatment curcumin 1 μM + tramiprosate.50 μM + MB 0.25μM treatment was found to decrease Tau phosphorylation, caspase expression and cholinergic dysfunction. Thus, it can be concluded that rotenone is a good chemical model for the simulation of EAE in cholinergic neuronal models in vitro, and that the molecules curcumin, tramiprosate and MB in individual or combined therapies, present promising results for the treatment of patients with this pathology.