La minociclina y el Sildenafil reducen el fenotipo de la enfermedad de Alzheimer familiar PSEN1 E280A en un modelo in vitro

Abstract

RESUMEN: La Enfermedad de Alzheimer (EA) es el trastorno neurodegenerativo más común a nivel mundial, representando entre el 60% y el 80% de los casos totales de demencia que afecta alrededor 50 millones de personas. Se estima que su progresión hacia el año 2050 se triplicará llegando a cifras cercanas a los 131 millones de casos, esto representa un grave problema a nivel socio-económico y de salud pública. La EA es un trastorno neurodegenerativo causal de un deterioro progresivo grave del sistema nervioso afectando múltiples sistemas biológicos del ser humano. La EA se caracteriza por síntomas específicos como pérdida de memoria, afectación de las habilidades psico-motoras, deterioro en las habilidades sociales, trastornos del habla, del comportamiento y la cognición. Neuropatológicamente, se demuestra por la presencia de signos como perdida del volumen de la masa encefálica, engrosamiento de la zona de la duramadre y de atrofia de circunvoluciones. Microscópicamente, se denota presencia de agregados proteicos intra y extracelulares compuestas de proteína β-amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares compuestos por la proteína TAU hiperfosforilada, neuritas distróficas, perdida de neuronas y gliosis. Los modelos de estudio in vivo e in vitro han permitido conocer procesos neuropatológicos relacionados con la EA y posibles tratamientos, pero aún no se sabe con exactitud qué causa la muerte neuronal en la mayoría de los casos, ni por qué hay diferentes factores causantes en la EA esporádica y familiar. Además, actualmente no existe un medicamento aprobado que revierta o detenga los procesos neurodegenerativos en la EA. Por lo cual, se hace de vital importancia los procesos investigativos que determinen nuevos blancos terapéuticos que puedan ser dirigidos a potenciales tratamientos. En la literatura se han evaluado diferentes compuestos de origen farmacéutico como la MC. Se ha reportado que la MC tiene el potencial de modular la expresión de proteínas como el péptido Aβ, causante de las placas seniles; también se ha señalado su interacción con cinasas, su capacidad de intervenir en las vías de señalización anti- apoptóticas, capacidad antiinflamatoria y antioxidante. Por otra parte, los inhibidores de la 5-fosfodiesterasa, como el SIL, posee su mayor potencial terapéutico al actuar en la elevación de los niveles de GMPc dependiente de óxido nítrico (NO). Interesantemente, se ha reportado que su uso mejora la función sináptica y carga de Aβ, teniendo acción antiinflamatoria y antioxidante. Dentro de este contexto, el presente proyecto está enfocado en la evaluación de las terapias con MC y SIL en el proceso de formación de ROS, el mantenimiento del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), la expresión de marcadores de estrés oxidativo, marcadores de procesos de apoptosis determinados en la vía intrínseca, la expresión y agregación de proteínas Aβ y TAU, en un modelo neuronal colinérgico (ChLNs), por medio del uso de técnicas de evaluación de expresión proteica como citometría de flujo e inmunofluorescencia. En este contexto las neuronas colinérgicas (NC) PSEN1 WT silvestres tratadas con el inhibidor del complejo 1 de la cadena transportadora de electrones rotenona (ROT) a una concentración de 10µM demostraron una elevada producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), disminución del potencial de membrana mitocondrial, producción de iAPPβ, proteína TAU hiperfosforilada y α Sinucleina fosforilada, además de expresar una elevación en las proteínas proapoptoticas p-JUN- TP53, PUMA y caspasa 3, representando la posibilidad de visibilizar una comparativa con las NC PSEN1 E280A. Así mismo la plataforma de experimentación en NC PSEN1 WT y E280A con MC y SIL demostraron que tienen la capacidad de disminuir significativamente la producción de ROS, mantener el ΔΨm, y restringir la activación de marcadores neuropatológicos asociados a la apoptosis como TP53, PUMA, Caspasa 3, y p-JUN, y proteínas Aβ y TAU, además favorecen el mejoramiento de la funcionalidad colinérgica en función del tránsito de Ca2+ intracelular ante el estímulo con acetilcolina (ACh); tomados en conjunto estos resultados, sugieren que la acción de MC y SIL pueden tener efectos positivos en el tratamiento de la EA.

ABSTRACT: Alzheimer's Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder worldwide, accounting for 60% to 80% of all dementia cases and affecting approximately 50 million people. It is estimated that by the year 2050, the number of AD cases will triple, reaching approximately 131 million cases. This represents a significant socio-economic and public health problem. AD is a neurodegenerative disorder that causes severe progressive impairment of the nervous system, affecting multiple biological systems in humans. It is characterized by specific symptoms such as memory loss, impairment of psychomotor skills, deterioration in social skills, speech disorders, behavioral changes, and cognitive decline. Neuropathologically, AD is manifested by signs such as brain mass volume loss, thickening of the dura mater, and atrophy of convolutions. Microscopically, it is characterized by the presence of intra- and extracellular protein aggregates composed of β-amyloid (Aβ) and neurofibrillary tangles composed of hyperphosphorylated TAU protein, dystrophic neurites, neuronal loss, and gliosis. In vivo and in vitro models have provided insights into neuropathological processes related to AD and potential treatments. However, the exact cause of neuronal death in the majority of cases and the different factors involved in sporadic and familial AD are still not fully understood. Currently, there is no approved medication that can reverse or halt the neurodegenerative processes in AD. Therefore, it is of vital importance to conduct research aimed at identifying new therapeutic targets that can be targeted for potential treatments. In the literature, various pharmacological compounds such as MC have been evaluated. It has been reported that MC has the potential to modulate the expression of proteins such as the Aβ peptide, which is responsible for the formation of senile plaques. It has also been noted for its interaction with kinases, its ability to intervene in anti-apoptotic signaling pathways, and its anti-inflammatory and antioxidant properties. On the other hand, 5-phosphodiesterase inhibitors such as SIL have their therapeutic potential in the elevation of nitric oxide (NO)-dependent cGMP levels. Interestingly, its use has been reported to improve synaptic function and reduce Aβ burden, as well as exhibit anti-inflammatory and antioxidant actions. Within this context, the present project focuses on the evaluation of MC and SIL therapies in the process of ROS formation, maintenance of mitochondrial membrane potential (ΔΨm), expression of oxidative stress markers, markers of apoptosis processes in the intrinsic pathway, and expression and aggregation of Aβ and TAU proteins in a cholinergic neuronal model (ChLNs). This will be achieved through the use of protein expression assessment techniques such as flow cytometry and immunofluorescence. In this context, wild-type Presenilin 1 (PSEN1) cholinergic neurons treated with the electron transport chain complex I inhibitor rotenone (ROT) at a concentration of 10µM demonstrated elevated reactive oxygen species (ROS) production, decreased mitochondrial membrane potential, production of iAPPβ, hyperphosphorylated TAU protein, and phosphorylated α-synuclein. Additionally, they showed increased expression of proapoptotic proteins p-JUN-TP53, PUMA, and caspase 3, allowing for a comparison with PSEN1 E280A cholinergic neurons. Similarly, the experimental platform using MC and SIL in PSEN1 WT and E280A cholinergic neurons demonstrated a significant decrease in ROS production, maintenance of ΔΨm, and inhibition of neuropathological markers associated with apoptosis, such as TP53, PUMA, Caspase 3, and p-JUN, as well as Aβ and TAU proteins. Furthermore, they promoted the improvement of cholinergic functionality in terms of intracellular Ca2+ transit upon acetylcholine (ACh) stimulation. Taken together, these results suggest that the action of MC and SIL may have positive effects in the treatment of AD.