Caracterización bioquímica y funcional de una nueva serina/treonina quinasa putativa (AKT-like) de Trypanosoma cruzi

Abstract

RESUMEN: Existe la necesidad de encontrar nuevas alternativas farmacológicas para la enfermedad de Chagas, una patología sistémica sin cura efectiva en su etapa crónica, debido a la baja eficiencia y la toxicidad de los pocos medicamentos disponibles para su tratamiento. Las proteínas quinasas son objetivos farmacológicos utilizados en el tratamiento de varios tipos de cáncer, debido a su papel esencial en vías de señalización y promoción de la supervivencia celular. La serina/treonina quinasa AKT-like ha sido propuesta como diana en el desarrollo de fármacos para el tratamiento de enfermedades parasitarias con resultados promisorios hasta la fecha. Por tanto, proponemos la identificación y validación funcional de una proteína asociada a la vía de señalización PI3K/AKT/TOR como potencial diana farmacológica, una posible segunda serina/treonina quinasa B-like/AKT de Trypanosoma cruzi. Mediante análisis bioinformáticos realizados en nuestro grupo y por Bachmaier et al. en 2013, se encontró una posible isoforma de la primera AKT reportada (UniProtKB ID 4D6D3), este nueva proteína (UniProtKB ID Q4DL90) presenta los tres dominios funcionales conservados; sin embargo, diverge en la región amino terminal con el dominio (FYVE/PHD) que no está en ninguna de las tres isoenzimas AKT humanas y cuya secuencia tiene una identidad máxima del 41% con los dominios FYVE/PHD humanos, un hecho que permite el diseño racional de compuestos que aprovechen estas diferencias con el parásito. En este trabajo, mediante herramientas de biología molecular se obtuvieron los plásmidos pETZT2-AKT-2 y pET28a-AKT-2 que permitieron la expresión de la proteína recombinante AKT2-2 like full-length en E. coli, al igual que el vector pET28a-ΔNtAKT-2 que expresó únicamente el dominio quinasa. La purificación se realizó mediante cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC); y la actividad quinasa se evaluó mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas en fase sólida (ELISA). Adicionalmente, se obtuvieron anticuerpos policlonales de conejo anti-AKT2-like que permitieron la detección de la proteína endógena en epimastigotes de T. cruzi tulahuen y Gal61S mediante ensayos de Western-blot. Los resultados experimentales nos permitieron validar la existencia de una segunda serina/treonina quinasa B-like en T. cruzi, lo que la convierte en una candidata como diana terapéutica para investigaciones futuras.