Morphological, cellular and molecular, characteristics associated with the acquisition of embryogenic competence in cell cultures of Theobroma cacao L., genotype “CNCh13”

Abstract

ABSTRACT: Somatic embryogenesis (SE) is a biotechnological tool with comparative advantages in mass plant propagation and other techniques such as genetic improvement, germplasm conservation, sanitation, and basic studies, among others. However, it has not been successfully established in many species, and in others like cacao, genotypes differ in their response to this process, limiting the mass propagation of elite genotypes. Given the complexity of morphogenetic processes that occur during SE, studies with new approaches and the integration of different areas of knowledge are required to lead to a better understanding and optimization of the process. Such studies have been scarcely explored in T. cacao, as well as the standardization of more efficient propagation methods such as the cultivation of embryogenic potential cells in suspension, which facilitate large-scale propagation. In this context, our research focused on studying the morphological, cellular, and genetic characteristics associated with the acquisition of embryogenic competence during this process in the elite cacao genotype CNCh13. After establishing the SE protocol, the induction of primary somatic embryos (PSE) was initiated, during which the morphological characterization of the embryogenic and non-embryogenic cultures obtained was carried out. We identified three types of callus: white non-embryogenic callus (WC), brown non-embryogenic callus (NEC), and embryogenic callus (EC). The latter was characterized by its yellowish coloration, granular appearance, and soft texture. Histochemical analyses of each type of callus and the PSE at different developmental stages highlighted that the EC was composed of different cell types, predominantly parenchyma cells (PA) storing starch granules (SG) and phenolic compounds (FC). These PA cells exhibited the ability to differentiate into competent cells (CC), which subsequently gave rise to embryogenic clusters (EMC) and proembryos (PE), ultimately forming embryos (PSE). At the genetic level, the expression profiles of genes related to SE were obtained using the RT-qPCR technique. We found the genes BBM, ABI3, AGL15, and IAA20 highly expressed in the globular embryo (GE), while the genes LEC2, WUS, SERK1, SERK2, and PIN1 showed lower expression levels. In the different types of callus the expression of all these genes was lower than in the GE. The establishment of cell suspension culture (CS) aimed at inducing embryo formation in this system was carried out from the EC with a standardized inoculum of 0.5 g in 6 ml of INDI medium. Homogeneous CS were obtained with a maximum growth rate of 0.1036 g/d and a doubling time of 6.69 d; however, embryo formation was not achieved under the evaluated experimental conditions. Notably, an improved response was obtained in the production of PSE in the EC cultured in liquid medium (ECS), with a reactivation of embryogenic potential identified, resulting in an average production of 300 embryos/g EC. Histological analyses of ECS confirmed the number of CC and EMC clusters. These results offer a promising alternative for mass propagation, without ruling out the possibility of achieving embryo formation in CS considering the morphogenetic and cellular aspects identified in this study, including transgenesis and genetic editing.

RESUMEN: La embriogénesis somática (ES) es una herramienta biotecnológica con ventajas comparativas en la propagación masiva de plantas y otras técnicas como el mejoramiento genético, conservación de germoplasma, saneamiento, estudios básicos entre otros. Sin embargo, no se ha logrado establecer en muchas especies y en otras como el cacao, los genotipos difieren en su respuesta a este proceso, limitando la propagación masiva de genotipos elite. Dada la complejidad de los procesos morfogenéticos que ocurren durante la ES, se requieren estudios con nuevas aproximaciones e integración de distintas áreas del conocimiento que conlleven a mejor compresión del proceso y su optimización. Este tipo de estudios han sido poco explorados en T. cacao, al igual que la estandarización de métodos de propagación más eficientes como el cultivo de células con potencial embriogénico en suspensión que facilitan la propagación a gran escala. Bajo este contexto, nuestra investigación se enfocó en estudiar las características morfológicas, celulares y genéticas asociadas a la adquisición de la competencia embriogénica durante este proceso en el genotipo élite de cacao CNCh13. Luego de establecido el protocolo de ES, se inició la inducción de embriones somáticos primarios (PSE), durante este desarrollo se realizó la caracterización morfológica de los cultivos embriogénicos y no embriogénicos obtenidos. Identificamos 3 tipos de callo: Callo no embriogénico blanco (WC), callo no embriogénico café (NEC) y callo embriogénico (EC). Este último se caracterizó por su coloración amarillosa, apariencia granular y textura suave. Los análisis histo-químicos en cada tipo de callo y de los PSE en distintos estadios de desarrollo, permitieron destacar que el EC estaba conformado por distintos tipos de células con predominio de células parenquimáticas (PA) almacenando gránulos de almidón (SG) y compuestos fenólicos (FC). Justo esas PA exhibieron capacidad de diferenciarse en células competentes (CC), que posteriormente dan lugar a clústeres embriogénicos (EMC) y proembriones (PE), que finalmente formaron los embriones (PSE). A nivel genético, se obtuvieron los perfiles de expresión de genes relacionados con la ES mediante la técnica RT-qPCR. Encontramos altamente expresados los genes BBM, ABI3, AGL15, y IAA20 en el embrión globular (GE), mientras que los genes LEC2, WUS, SERK1, SERK2 y PIN1 presentaron niveles de expresión más bajo. En los diferentes tipos de callo, la expresión de todos estos genes fue inferior al GE. El establecimiento del cultivo de células en suspensión (CS) con miras a inducir la formación de embriones en este sistema se realizó a partir del EC con un inóculo estandarizado de 0,5g en 6ml de medio INDI. Se obtuvieron CS homogéneas con una tasa de crecimiento máxima de 0.1036 g/d y un tiempo de duplicación 6.69d, no obstante, no se consiguió la formación de embriones bajos las condiciones experimentales evaluadas. Notablemente, se logró una respuesta mejorada en la producción de PSE en el EC cultivado en medio líquido (ECS), identificándose reactivación del potencial embriogénico con una producción promedio de 300 embriones/gEC. Los análisis histológicos de ECS confirmaron la cantidad de grupos de CC y EMC. Estos resultados ofrecen una alternativa prometedora para la propagación masiva, sin descartar la posibilidad de lograr en las CS la formación de embriones considerando los aspectos morfogenéticos y celulares identificados en este estudio incluyendo la transgénesis y la edición genética.