Validación biofísica y funcional de un inhibidor alostérico de la proteína Akt -like de Trypanosoma cruzi como alternativa terapéutica para la enfermedad de Chagas

Abstract

RESUMEN: La identificación y caracterización estructural de dianas terapéuticas tienen roles importantes en el desarrollo de fármacos que modulen de forma potente y selectiva sus funciones celulares. La necesidad actual de tratamientos más seguros y eficaces para los pacientes que padecen enfermedades tropicales desatendidas, como la enfermedad de Chagas causada por el parásito Trypanosoma cruzi, ha impulsado la búsqueda y caracterización de nuevos blancos farmacológicos enzimáticos. Los avances en biología celular y molecular han permitido identificar la función y la esencialidad de varias quinasas en los procesos de señalización, convirtiéndolas en candidatas atractivas para los compuestos antiparasitarios. Con el objetivo de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas eficaces contra la enfermedad de Chagas, estudiamos la Akt-like de T. cruzi (TcAkt) como potencial diana farmacológica. En este estudio, integramos técnicas de biología molecular, bioquímicas, biofísicas, y computacionales para la caracterización estructural y funcional de la proteína TcAkt y la validación de su interacción con un potencial inhibidor (UBMC-4). Inicialmente, obtuvimos la proteína recombinante TcAkt-6His soluble y activa, al igual que su dominio de homología a pleckstrin (PH), ambas con la calidad necesaria para estudios biofísicos. Posteriormente, mediante el acople de técnicas de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) con simulaciones de Dinámica Molecular generamos información detallada de las propiedades estructurales del dominio PH de la TcAkt y su unión a los ligandos de fosfatidilinositol fosfato (PIP). Con base en estos hallazgos, proponemos un modelo para el mecanismo de acción de la TcAkt que implica la disrupción inducida por los PIP de la interfaz intramolecular entre el dominio quinasa y el dominio PH que resulta en una conformación abierta que permite su activación. De igual forma, estudiamos la interacción de la proteína TcAkt con el compuesto UBMC-4 contrastando resultados generados por Fluorimetría Diferencial de Barrido, Calorimetría de titulación isotérmica y RMN. Nuestros resultados indican que el compuesto UBMC-4 interactúa con la proteína completa, pero no interactúa con el dominio PH amino-terminal aislado presentando una baja afinidad por la proteína, convirtiéndose es un andamiaje para la optimización y desarrollo de nuevos inhibidores específicos de la TcAkt. Nuestro análisis estructural en profundidad de la TcAkt revela sitios potenciales para el desarrollo de nuevos fármacos contra la enfermedad de Chagas, localizados en regiones esenciales para la actividad. Adicionalmente, mediante el uso de herramientas bioinformáticas y bioquímicas, reportamos una nueva quinasa de la familia AGC de Trypanosoma cruzi con un dominio FYVE acoplado a un dominio Pleckstrin con similitud a la TcAkt canónica del parásito. Realizamos su análisis estructural y funcional resaltando sus similitudes y diferencias. Validamos su expresión y establecimos su papel en la viabilidad del parásito utilizando la tecnología CRISPR/Cas9. A través de una red teórica de interacción proteína-proteína, sugerimos su vinculación a la ruta PI3K/Akt/Tor, lo que la convierte en una enzima de gran interés para futuros estudio, ampliando el conocimiento bioquímico y metabólico del parásito.

ABSTRACT: The identification and structural characterization of therapeutic targets play crucial roles in the development of drugs that modulate their cellular functions in a potent and selective manner. The current need for safer and more effective treatments for patients suffering from neglected tropical diseases, such as Chagas disease caused by the Trypanosoma cruzi parasite, has driven the search and characterization of new enzymatic pharmacological targets. Advances in cellular and molecular biology have allowed the identification of the function and essentiality of several kinases in signaling processes, making them attractive candidates for antiparasitic compounds. To develop new effective therapeutic strategies against Chagas disease, we studied the T. cruzi Akt-like kinase (TcAkt) as a potential pharmacological target. In this study, we integrated molecular biology, biochemical, biophysical, and computational techniques to structurally and functionally characterize the TcAkt protein and validate its interaction with a potential inhibitor (UBMC-4). Initially, we obtained soluble and active recombinant TcAkt-6His protein, as well as its pleckstrin homology (PH) domain, both of which were suitable for biophysical studies. Subsequently, by coupling Nuclear Magnetic Resonance (NMR) techniques with Molecular Dynamics simulations, we generated detailed information about the structural properties of the PH domain of TcAkt and its binding to phosphatidylinositol phosphate (PIP) ligands. Based on these findings, we propose a model for the mechanism of action of TcAkt, which involves PIP-induced disruption of the intramolecular interface between the kinase domain and the PH domain, resulting in an open conformation that allows activation. Similarly, we studied the interaction of the TcAkt protein with the UBMC-4 compound by comparing results generated by Differential Scanning Fluorimetry, Isothermal Titration Calorimetry, and NMR. Our results indicate that UBMC-4 interacts with the full-length protein, but not with the isolated amino-terminal PH domain, exhibiting low affinity for the protein. This positions UBMC-4 as a scaffold for the optimization and development of new specific TcAkt inhibitors. Our in -depth structural analysis of TcAkt reveals potential sites for the development of new drugs against Chagas disease, located in regions essential for activity. Additionally, using bioinformatic and biochemical tools, we report a new AGC family kinase from Trypanosoma cruzi with a FYVE domain coupled to a Pleckstrin domain, showing similarity to the canonical TcAkt of the parasite. We performed its structural and functional analysis, highlighting its similarities and differences. We validated its expression and established its role in parasite viability using CRISPR/Cas9 technology. Through a theoretical protein-protein interaction network, we suggest its linkage to the PI3K/Akt/Tor pathway, making it an enzyme of great interest for future studies, expanding the biochemical and metabolic knowledge of the parasite.