Role of myonectin in the regulation of the lipid metabolism in the metabolic syndrome

Abstract

ABSTRACT: Metabolic syndrome (MS) encompasses conditions including hypertension, central obesity, glycemic dysfunctions, and atherogenic dyslipidemia, affecting ~40% of adults in Colombia and worldwide. This condition increases mortality from all causes. Myokines, molecules secreted by the skeletal muscle with autocrine, paracrine, and endocrine actions, emerge as key players in the pathophysiology of the MS, modulating the metabolism of tissues such as muscle, adipose, and liver. Myonectin is a myokine which has shown significant effects on lipid regulation, including reducing free fatty acids (FFA) in serum in murine models and increasing the uptake of these substrates in adipocytes, through the upregulation of fatty acid transporters (e.g., Cd36 and Fabp4). Additionally, myonectin increases the expression of molecular markers related to metabolism and mitochondrial biogenesis in adipocytes and skeletal muscle (e.g., Tfam, Nrf1). However, there is no evidence about the effect of myonectin on the mitochondrial function in the living skeletal muscle cell, despite the key role of this tissue in the pathophysiology of the MS. Also, human studies have not agreed with basic sciences data and have yielded contradictory results; some show a positive correlation of myonectin with MS outcomes, while others indicate a negative correlation. Considering this context, the purpose of this study was to evaluate the role of myonectin in lipid metabolism regulation at various complexity levels (i.e., body, serum, tissue, and cell) to deepen our understanding of its role in the pathophysiology of the MS. This research implemented two study models: one in humans at metabolic risk, defined by the presence of at least one MS component of both sexes, aged between 40 and 60 years, and another in murine skeletal muscle cells. The human model included a secondary analysis of databases and samples from the Intraining-MET study (NCT03087721), addressing a cross- sectional design and a randomized controlled trial (RCT). In this model, serum myonectin was quantified by enzyme-linked immunosorbent assay, lipid profile by conventional techniques, FFA by gas chromatography, body composition assessed by dual-energy X-ray absorptiometry, and intramuscular lipid content by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy in the right vastus lateralis muscle. The cross-sectional study considered participants at metabolic risk but without MS (with between 1 and less than 3 MS components, n = 29) and with MS (≥3 MS components and insulin resistance, n = 61). In the RCT, subjects with MS (n = 60) were assigned to either high-intensity interval training (HIIT,

n = 29) or moderate-intensity continuous training (MICT, n = 31) for 12 weeks. The cellular model focused on assessing mitochondrial function in C2C12 myoblasts and isolated muscle fibers of mice. This analysis included measuring the oxygen consumption rate (OCR) via extracellular flux assays, mitochondrial membrane potential (Δψm), and levels of reactive oxygen species (particularly superoxide) in C2C12 myoblasts using flow cytometry. The results from the human cross-sectional study indicated that serum myonectin levels were lower in participants with MS and showed a negative correlation with central obesity in individuals with metabolic risk factors, after multiple adjustments (R2=0.477, p<0.001), suggesting that low concentrations of this myokine may be linked to a higher abdominal fat accumulation. In the RCT, HIIT did not prove superior in improving serum lipid markers compared to MICT, although it increased myonectin significatively (p=0.042), with a large effect size, when compared to baseline values. Also, both interventions reduced fat mass (FM) after 12 weeks without parallel changes in serum myonectin levels, which could indicate a limited effect of this myokine on exercise-induced fat mobilization in the medium term. Moreover, the myonectin treatment of murine, healthy or metabolically altered C2C12 muscle cells, and mature, isolated fibers from healthy or obese mice, induced an increase in OCR and adenosine triphosphate (ATP) production linked to oxidative phosphorylation in control muscle fibers, with no significant changes in Δψm or superoxide production levels. We conclude that low myonectin concentrations in individuals with MS may be linked to increased abdominal fat accumulation, which contributes to the pathophysiology of this syndrome. This myokine appears to have a minor effect on the serum lipid outcomes and intramuscular fat content. Only HIIT increased myonectin in serum. Our evidence suggests a low mediating effect of this myokine on lipid outcomes during exercise. On the other hand, findings in cellular models indicate that myonectin promotes a healthy metabolic phenotype, although it is not sufficient to completely reverse the effects of a severe or chronic condition of lipid alteration. Studies in cellular models are more convincing of a measurable and beneficial effect of myonectin on the metabolism, than studies in humans. Given that myonectin seems to be a low, and slow, responding myokine, its study in humans likely requires larger samples and longer times of observation.

As a claim of novelty, this Thesis is the first to show: i) an inverse correlation of myonectin with android obesity in subjects with MS, after multiple adjustments; ii) the lack of correlation of myonectin with myosteatosis in humans; iii) an increase in myonectin after a HIIT intervention in humans; iv) an increase in OCR and ATP production linked to oxidative phosphorylation in muscle fibers incubated with myonectin. All these findings increase our knowledge about the role of myonectin in the regulation of the lipid metabolism and the pathophysiology of the MS.

RESUMEN: El síndrome metabólico (SM) es un conjunto de alteraciones que incluye hipertensión, obesidad central, disfunciones glucémicas y dislipidemia aterogénica, afectando al ~40% de los adultos en Colombia y en el mundo. Esta condición incrementa la mortalidad por todas las causas. Las mioquinas, moléculas secretadas por el músculo esquelético con acción autocrina, paracrina y endocrina, emergen como actores clave en la fisiopatología del SM, modulando el metabolismo de tejidos como el muscular, adiposo y hepático. La mionectina es una mioquina que ha demostrado efectos significativos en la regulación lipídica, como la reducción de los ácidos grasos libres (AGL) en el suero de modelos murinos y el aumento en la captación de estos sustratos en adipocitos, efecto logrado mediante la elevación en la expresión de transportadores de ácidos grasos (e.g., Cd36 y Fabp4). Adicionalmente, mionectina incrementa la expresión de marcadores moleculares relacionados con el metabolismo y la biogénesis mitocondrial en adipocitos y músculo esquelético (e.g., Tfam, Nfr1). Sin embargo, no hay evidencia del efecto de mionectina sobre la función mitocondrial en células musculares vivas, a pesar del importante papel de este tejido en el metabolismo y en la fisiopatología del SM. Además, los estudios en humanos han arrojado resultados contradictorios; algunos muestran una correlación positiva de mionectina con los desenlaces del SM, mientras que otros indican una correlación negativa. Considerando este contexto, el propósito de este estudio fue evaluar el papel de la mionectina en la regulación del metabolismo lipídico a distintos niveles de complejidad (corporal, sérico, tisular y celular), con la finalidad de profundizar en su papel en la fisiopatología del SM. La presente investigación implementó dos modelos de estudio: uno en humanos con riesgo metabólico, definido por la presencia de al menos un componente del SM —de ambos sexos, entre 40 y 60 años— y otro en células musculares esqueléticas murinas. El modelo humano incluyó un análisis secundario de datos y muestras del estudio Intraining-MET (NCT03087721), abordando un diseño transversal y un ensayo controlado aleatorizado (ECA). En este modelo, la mionectina sérica fue cuantificada mediante ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas, el perfil lipídico por técnicas convencionales, los AGL por cromatografía de gases, la composición corporal se evaluó mediante absorciometría de rayos X de doble energía, y el contenido lipídico intramuscular mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear de protón en el músculo vasto lateral derecho. El estudio

transversal contempló participantes con riesgo metabólico, pero sin SM (con 1 o 2 componentes del SM, n = 29) y con SM (≥3 componentes del SM y resistencia a la insulina, n = 61). En el ECA, los sujetos con SM (n = 60) fueron asignados a entrenamiento en intervalos de alta intensidad (HIIT, n = 29) o entrenamiento continuo de intensidad moderada (MICT, n = 31) por 12 semanas. El modelo celular se centró en evaluar la función mitocondrial en mioblastos C2C12 y fibras musculares aisladas de ratones. Este análisis incluyó la medición de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) mediante ensayos de flujo extracelular, el potencial de membrana mitocondrial (Δψm) y los niveles de especies reactivas de oxígeno (particularmente superóxido) en los mioblastos C2C12, utilizando citometría de flujo. Los resultados del estudio transversal en humanos indicaron que los niveles séricos de mionectina fueron inferiores en participantes con SM y mostraron una correlación negativa con la obesidad central en individuos con factores de riesgo metabólico, después de ajustes por múltiples covariables (R2=0.477, p<0.001), sugiriendo que concentraciones bajas de esta mioquina podrían estar vinculadas con una mayor acumulación de grasa abdominal. En el ECA, el HIIT no demostró ser superior en mejorar los marcadores lipídicos séricos comparado con el MICT, aunque incrementó significativamente, y con un tamaño del efecto grande, la mionectina circulante (p=0.042). Ambas intervenciones redujeron la masa grasa tras 12 semanas sin cambios paralelos en los niveles séricos de mionectina, sugiriendo un efecto limitado de esta mioquina en la movilización de grasa inducida por el ejercicio a mediano plazo. Por otra parte, los ensayos en mioblastos C2C12 controles y con alteraciones metabólicas, y fibras musculares aisladas de ratones adultos controles y obesos, revelaron que el tratamiento con mionectina aumentó la OCR y la producción de adenosín trifosfato (ATP) vinculada a la fosforilación oxidativa en fibras musculares control, sin cambios significativos en el Δψm ni la producción de niveles de superóxido. Concluimos que las bajas concentraciones de mionectina en personas SM podrían estar vinculadas con una mayor acumulación de grasa abdominal, lo cual contribuye a la fisiopatología de este síndrome. Esta mioquina parece tener un efecto menor sobre los desenlaces lipídicos séricos y el contenido de grasa intramuscular. Sólo HIIT aumentó de manera significativa los niveles de mionectina, y nuestra evidencia sugiere un efecto

mediador bajo de esta mioquina en los desenlaces lipídicos. Por otra parte, los hallazgos en modelos celulares indican que la mionectina promueve un fenotipo metabólico saludable, aunque no es suficiente para revertir completamente, los efectos de una condición severa o crónica de alteración lipídica. Los estudios con modelos celulares muestran de manera más convincente un efecto medible, benéfico de mionectina sobre el metabolismo, que los estudios en humanos. Dado que la respuesta de mionectina ante diferentes estímulos parece ser pequeña y lenta, los futuros estudios en humanos deben tener muestras más grandes y mayores tiempos de observación. Como declaración de novedad, esta Tesis es la primera en mostrar: i) una correlación negativa entre mionectina y la obesidad androide en humanos con SM, después de múltiples ajustes; ii) la falta de correlación entre mionectina y la mioesteatosis en humanos; iii) un incremento de mionectina sérica después de una intervención con HIIT; iv) un incremento en la OCR y el ATP asociado a fosforilación oxidativa en fibras musculares incubadas con mionectina. Estos hallazgos incrementan nuestro conocimiento sobre el papel de mionectina en la regulación del metabolismo lipídico y su papel en la fisiopatología del SM.