Determinación de agentes virales en pacientes que presentan síndrome febril agudo con sospecha por dengue en la frontera nororiental colombo-venezolana

Abstract

RESUMEN: El síndrome febril agudo indiferenciado (SFAI) continúa siendo un importante problema de salud pública principalmente en países tropicales y subtropicales. Además, existen un amplio número de agentes etiológicos implicados en ocasionarlo, entre los que se encuentran los virus. En los últimos años, han tenido un gran impacto social, económico y en salud pública. El objetivo de este trabajo de investigación fue determinar la circulación de agentes virales en pacientes con SFAI con sospecha por dengue en la frontera nororiental colombo-venezolana en dos cohortes de estudio (2015-2016 y 2018-2020). Para ello, se recolectaron en Cúcuta y Villa del Rosario, Norte de Santander durante el 2018- 2020 sueros de pacientes que presentaban fiebre menor de 7 días y que cumplían con criterios clínicos y epidemiológicos de caso sospechoso por DENV (Cohorte II). Adicionalmente, por un estudio previo realizado por nuestro grupo de investigación, se tenían almacenadas 157 muestras de sueros de pacientes con sospecha por dengue recolectados en los años 2015-2016 en Villa del Rosario (Cohorte I). A los sueros recolectadas de la Cohorte II se les extrajo ARN, se hizo detección molecular para los géneros Flavivirus y Alphavirus. Posteriormente, se hizo detección molecular para las especies de arbovirus circulantes en la región (DENV, CHIKV y ZIKV). Luego, se realizó una amplificación del gen de envoltura completo para los serotipos DENV-1, DENV-2 y DENV-3, obteniendo algunas secuencias parciales del gen de envoltura de DENV-1 y DENV-2. Los amplicones conseguidos se secuenciaron por el método de Sanger y con estas secuencias se realizó un análisis filogenético y filogeográfico. Se construyeron árboles filogenéticos usando el Software MEGA 7.0 y los análisis filogeográficos utilizando el paquete BEAUti/BEAST v1.8.4. Finalmente, con el fin de caracterizar el viroma a las muestras negativas de las cohortes I y II (no DENV, CHIKV y/o ZIKV), se les efectuó pre-tratamientos y se secuenciaron mediante Oxford nanopore technologies (ONT) e Illumina. A continuación, a las lecturas obtenidas se les determinó la calidad, se limpiaron y se les realizó asignación taxonómica mediante CentrifugeV1.0.4 y se analizaron con el sistema Genome Detective. Se analizaron 194 muestras de pacientes pertenecientes de la cohorte II, encontrando una frecuencia 42 % de los arbovirus DENV, CHIKV y/o ZIKV, también co-infecciones en el 12 %. Los análisis filogenéticos y filogeográficos de DENV-1 y DENV-2, se hallaron múltiples introducciones de DENV entre Colombia y Venezuela; además que las secuencias de DENV-1 se encontraron dentro del genotipo V, mientras las secuencias de DENV-2 pertenecían al genotipo asiático/americano. Respecto a la caracterización el viroma en los ARN de las muestras de suero negativas para DENV, CHIKV y ZIKV, la familia viral de mayor abundancia fue la Salasmaviridae, seguido Flaviviridae, Poxviridae, Alloherpesviridae, Partitiviridae, Calciviridae y Herpesviridae. Los géneros virales más abundantes fueron Claudivirus, seguido Hepacivirus, Vesivirus, Betapartivirus y Citomegalovirus. Se logró ensamblar e identificar influenza A virus, vaccinia virus, hepatovirus A y coronavirus. Con este trabajo de investigación se observa que a pesar de la disponibilidad de algoritmos de diagnóstico clínica y laboratorio, se necesitan paneles de diagnóstico más amplios que incluyan otros virus con el fin de mejorar la precisión diagnóstica de los pacientes con SFAI.

ABSTRACT: Acute undifferentiated febrile illness (AUFI) continues to be an important public health problem, mainly in tropical and subtropical countries. Moreover, there are numerous etiological agents involved in this disease, such as viruses. Which in recent years have had a great social, economic, and public health impact. The aim of this research was to determine the circulation of viral agents in patients with AUFI suspected of having dengue on the northeastern Colombia-Venezuela border in two study cohorts (2015–2016 and 2018–2020). To achieve this goal, serum samples were collected from Cucuta and Villa del Rosario, Norte de Santander, during 2018–2020 from patients who had a fever for less than 7 days and who met clinical and epidemiological criteria for a suspected DENV case (Cohort II). Additionally, due to a previous study carried out by our research group, 157 serum samples from patients with suspected dengue fever collected between 2015 and 2016 in Villa del Rosario (Cohort I) were stored. RNA was extracted from the samples collected from Cohort II; molecular detection was performed for the Flavivirus and Alphavirus genera; and the positive samples were subjected to molecular detection for the arbovirus species circulating in the region (DENV, CHIKV, and ZIKV). Subsequently, a phylogenetic and phylogeographic analysis was performed on the DENV-positive samples from both cohorts (DENV-1 and DENV-2), for which the envelope gene was amplified and sequenced by the Sanger method. Then, with the sequences obtained, phylogenetic trees were constructed using MEGA 7.0 software, and phylogeographic analyses were performed using the BEAUti/BEAST v1.8.4 package. In the end, in order to characterize the virome of the negative samples of cohorts I and II, they were pretreated and sequenced with help from Oxford Nanopore Technologies (ONT) and Illumina. Next, the quality of the reads obtained was determined, the reads were cleaned, taxonomic assignment was carried out using Centrifuge V1.0.4, and the reads were analyzed with the Genome Detection System. In 194 samples from patients belonging to cohort II were analyzed, finding a frequency of 42% of the arboviruses DENV, CHIKV, and/or ZIKV, and coinfections were detected in 12%. Phylogenetic and phylogeographic analyses of DENV1 and DENV-2 revealed multiple introductions of DENV between Colombia and Venezuela. In addition, the DENV-1 sequences were found within genotype V, while the DENV-2 sequences belonged to the Asian/American genotype. Regarding the characterization of the virome in the RNA of serum samples negative for DENV, CHIKV, and ZIKV, the most abundant viral family was Salasmaviridae, followed by Flaviviridae, Poxviridae, Alloherpesviridae, Partitiviridae, Calciviridae, and Herpesviridae. The most abundant viral genus was Claudivirus, followed by Hepacivirus, Vesivirus, Betapartivirus, and Cytomegalovirus. It was possible to assemble and identify influenza A virus, vaccinia virus, hepatovirus A, and coronavirus. Despite the availability of clinical and laboratory diagnostic algorithms, broader diagnostic panels that include other viruses are needed to improve the diagnostic accuracy of patients with AUFI.