Efecto de la centrifugación sobre la membrana plasmática y el ADN de espermatozoides bovinos

Abstract

ABSTRACT: The aim of this study was to evaluate the effects of different times of centrifugation on plasma membrane integrity and DNA of bovine sperm cells, by means of the hyposmotic test (HOST) and the comet assay, respectively. The sperm cells were centrifuged at 700 x g for 10, 30 or 45 min. No-centrifuged thawed semen served as negative control whereas hydrogen peroxide (H2O2) (200 mM) treated sperm cells were used as a positive control. The results indicate that while the integrity of the plasma membrane was not affected by centrifugation, bovine sperm DNA was damaged independently of centrifugation times. Significant differences between negative control and treatments were found (p < 0.05) and in the same way, between treatments and positive control, where the damage for oxidative stress was greater. These results indicate that centrifugation could be detrimental for in vitro bovine embryo production. Additionally, some grade of DNA fragmentation in not centrifuged sperm cells (negative control) was registered, suggesting that DNA of bovine sperm cells could be affected by other factors, probably freezing procedure.

RESUMEN: El objetivo de este estudio fue determinar si la integridad de la membrana plasmática y el ADN de los espermatozoides pueden ser afectados por la centrifugación realizada en el proceso de lavado y selección. Los espermatozoides fueron sometidos a diferentes tiempos de centrifugación (10, 30 y 45 min); se utilizó un control negativo con espermatozoides no centrifugados y un control positivo con espermatozoides sometidos a estrés oxidativo con peróxido de hidrógeno (H2O2) (200 μM). Para evaluar la integridad de la membrana se utilizó la prueba hipoosmótica (HOST) y para evaluar la fragmentación del ADN se utilizó el ensayo cometa: El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Fisher. La centrifugación durante 10, 30 y 45 min, presentó un efecto estadísticamente significativo sobre el daño en el ADN, respecto de los espermatozoides no centrifugados (p < 0.05). Además, se observó diferencia estadística significa (p < 0.05) entre los espermatozoides centrifugados a diferentes tiempos con respecto al control positivo realizado con H2O2 (200 µM). La comparación de medias no indicó diferencia estadística significativa entre los espermatozoides no centrifugados y los centrifugados por un periodo de 10 y 30 min (p > 0.05) en la reacción positiva a la prueba HOST, lo cual sí sucedió (p < 0.05) al comparar los no centrifugados y los centrifugados por 45 min. El control positivo realizado con H2O2 presentó diferencia significativa (p < 0.05) con el resto de los tratamientos. En conclusión, los resultados del presente trabajo sugieren que la centrifugación de los espermatozoides durante 10, 30 ó 45 min a 700 x g para la realización del gradiente diferencial de Percoll, tiene un efecto deletéreo sobre el ADN de los espermatozoides bovinos y que la centrifugación por 45 min además de causar daño en el ADN produce pérdida de la integridad de la membrana plasmática.