Adaptación vascular para irrigar cáncer de colon en humanos: Mecanismos modificados por el ambiente tumoral

Abstract

RESUMEN: Generar conocimiento acerca del sistema vascular tumoral y su rol en el desarrollo del cáncer tiene potencial impacto en su tratamiento. La virtual totalidad de este tipo de estudios se dedica a caracterizar la angiogénesis, por lo que este trabajo no se enfocará en esta. Dos aspectos poco explorados de las adaptaciones vasculares en cáncer son los cambios en la arquitectura de la pared vascular (en íntima, media y adventicia), y/o en la reactividad vascular (VR) de las arterias que irrigan el tumor. Por ello, se propuso cuantificar estos mecanismos de adaptación vascular en cáncer. Metodología: en arterias tumorales de colon (TU), arterias extratumorales (ET) del mismo paciente y arterias mesentéricas de pacientes sin cáncer (NT), se determinaron por histología (hematoxilina y eosina) los cambios en la morfología vascular; en baño de órgano aislado se evaluó la VR expresada en pD2 y Emax, en respuesta a KCl, fenilefrina (PE), endotelina-1 (ET-1), U46619 (análogo del tromboxano A2), carbacol (CCh), bradikinina (BK), isoproterenol y factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF). Además, se cuantificó la expresión de los receptores tromboxano-prostanoides (TP), α1, β2, receptor de endotelina A (ETA) y B (ETB), receptores uno (VEGFR1) y dos (VEGFR2) de VEGF por inmunofluorescencia, normalizando los resultados con la expresión de los receptores en NT. Las comparaciones entre grupos se hicieron con ANOVA. Resultados: se procesaron trece pacientes no tumorales entre 46±9 años, seis mujeres y siete hombres, y Veinticinco pacientes con diagnóstico de adenocarcinoma de CAc, 15 mujeres y 10 hombres. Se encontró hiperplasia del 50% en media y >200% en íntima de arterias de los grupos ET y TU. En VR, se encontraron diferencias significativas en sensibilidad a KCl (pD2: NT, 1.6±0.04; ET, 1.8±0.02; TU, 1.8±0.03, p=0.02). Al estímulo con PE aumentó la pD2 (pD2: NT, 5.7±0.008; ET, 6.2±0.09; TU, 6.1±0.13, p=0.004) y Emax (Emax: NT, 91±12%KCl; ET, 137±6.5% y TU, 117±18%; p=0.04) en ET y TU. A U46619 se presentó un aumento de sensibilidad (pD2: NT, 7.08±0.1; ET, 7.3±0.09; TU, 7.2±0.1, p=0.06) en ET y TU. No se encontraron diferencias en la VR a ET-1. En relajación, el 70% de los pacientes con cáncer presentó Emax a BK inferior al 30% indicando baja viabilidad endotelial, debido a esto los ensayos de relajación se hicieron solo con paciente que presentaran un Emax a BK superior al 30%. Se encontró un aumento en sensibilidad a CCh (Emax: NT, 1.3±8%; ET, 49.6±14% y TU, 41.5±13% de relajación; p=0.009) en ET y TU. Al estímulo con BK disminuyó la pD2 (pD2: NT, 6.2±0.16; ET, 6.01±0.2; TU, 6.05±0.12, p=0.02) y Emax (Emax: NT, 91±20%; ET, 53.4±5.6% y TU, 44.08±1% de relajación, p=0.03) en ET y TU. Al estímulo con isoproterenol aumentó la sensibilidad (pD2: NT, 6.5±0.17; ET, 8.3±0.3; TU, 7.7±0.18, p=0.001) y Emax (Emax: NT, 8.4±2%; ET, 28.2±5% y TU, 29.5±9.2% de relajación; p=0.005) en ET y TU. No se encontraron diferencias en la VR a VEGF. En la cuantificación de expresión se evidenció aumento en la íntima de los receptores α1, TP y VEGFR2 en ET, y TP, β2 y VEGFR1 en TU. En la túnica media aumentó la expresión de α1 y TP en ET y solo TP en TU. No se encontraron diferencias en la expresión de ETA y ETB, ni en adventicia para ningún receptor. Conclusión: el tumor induce engrosamiento de la pared vascular superior al 50% en la íntima y la media, generando cambios en la VR que favorecen la contracción adrenérgica y por tromboxano A2, por aumento de sus receptores y disfunción endotelial. Al tiempo que la arteria favorece la relajación colinérgica y β2- adrenérgica como compensación a la disminución de relajación dependiente de óxido nítrico. Estas modificaciones podrían favorecer un ambiente hipóxico en el tumor retroalimentando así vías de señalización como VEGF/PTEN/GSK3B/NF-kB que facilitan el desarrollo tumoral y las adaptaciones vasculares. A partir de este trabajo se establece una plataforma de investigación basada en los mecanismos de adaptación vascular en cáncer y donde se podría explorar el potencial farmacológico de las vías de contracción/relajación alteradas. Esta tesis consta de seis capítulos y dos anexos. Los capítulos dos y tres, y los anexos, son artículos que fueron publicados con autoría principal o co-autoría de Nelson Cupitra durante su formación doctoral. Los capítulos cuatro y cinco son dos artículos más que serán sometidos antes de la defensa pública de la tesis, con autoría principal de Nelson Cupitra. En total, con los cuatro artículos ya publicados, esta tesis suma un factor de impacto de 12,05. Esta tesis fue defendida el 28 de enero de 2021 y obtuvo la calificación summa cum laude (4.9 sobre 5)

ABSTRACT: To generate knowledge about the tumor vascular system and its role in the development of cancer has a potential impact on its treatment. Virtually all of these types of studies are dedicated to characterizing angiogenesis, so this work will not focus on it. Two little-explored aspects of vascular adaptations in cancer are changes in the architecture of the vascular wall (intima, media, and adventitia), and/or in vascular reactivity (VR) of the arteries supplying the tumor. Therefore, it was proposed to quantify these vascular adaptation mechanisms in cancer. Methodology: in colon tumor arteries (TU), extratumoral arteries (ET) from the same patient and mesenteric arteries from patients without cancer (NT), the changes in vascular morphology were determined by histology (hematoxylin and eosin); In isolated organ bath, VR expressed in pD2 and Emax was evaluated, in response to KCl, phenylephrine (PE), endothelin-1 (ET-1), U46619 (analog of thromboxane A2), carbachol (CCh), bradykinin (BK), isoproterenol and vascular endothelial growth factor (VEGF). Furthermore, the expression of thromboxane-prostanoid receptors (TP), α1, β2, endothelin receptor A (ETA) and B (ETB), receptors one (VEGFR1) and two (VEGFR2) of VEGF was quantified by immunofluorescence, normalizing the results with the expression of the receptors in NT. Comparisons between groups were made with ANOVA. Results: thirteen non-tumor patients (46±9 years old), six women and seven men, and twenty-five patients with a diagnosis of colon cancer adenocarcinoma (7±3.1 years old), 15 women and 10 men, were processed. Hyperplasia of 50% was found in the middle and> 200% in the intima of arteries of the ET and TU groups. In VR, significant differences were found in sensitivity to KCl (pD2: NT, 1.6±0.04; ET, 1.8±0.02; TU, 1.8±0.03, p=0.02). Upon stimulation with PE increased the pD2 (pD2: NT, 5.7±0.008; ET, 6.2 ± 0.09; TU, 6.1±0.13, p=0.004) and Emax (Emax: NT, 91±12% KCl; ET, 137±6.5% and TU, 117±18%; p=0.04) in ET and TU. U46619 showed an increase in sensitivity (pD2: NT, 7.08±0.1; ET, 7.3±0.09; TU, 7.2±0.1, p=0.06) in ET and TU. No differences were found in VR at ET-1. In relaxation, 70% of cancer patients presented Emax at BK lower than 30% indicating low endothelial viability, due to this the relaxation tests were performed only with patients who presented an Emax at BK greater than 30%. An increase in sensitivity to CCh (Emax: NT, 1.3±8%; ET, 49.6±14% and TU, 41.5±13% relaxation; p=0.009) was found in ET and TU. Upon stimulation with BK, pD2 (pD2: NT, 6.2±0.16; ET, 6.01±0.2; TU, 6.05±0.12, p=0.02) and Emax (Emax: NT, 91±20%; ET, 53.4±5.6%) decreased and TU, 44.08±1% relaxation, p=0.03) in ET and TU. When stimulated with isoproterenol, sensitivity increases (pD2: NT, 6.5±0.17; ET, 8.3±0.3; TU, 7.7±0.18, p=0.001) and Emax (Emax: NT, 8.4±2%; ET, 28.2±5% and TU, 29.5±9.2% relaxation; p=0.005) in ET and TU. No differences were found in VR to VEGF. In the quantification of expression, an increase in the intima of the α1, TP and VEGFR2 receptors was evidenced in ET, and TP, β2 and VEGFR1 in TU. In the tunica media, the expression of α1 and TP increases in ET and only TP in TU. No differences were found in the expression of ETA and ETB, nor in adventitia for any receptor. Conclusion: the tumor induces thickening of the vascular wall greater than 50% in the intima and media, generating changes in VR that favor adrenergic contraction and by thromboxane A2, due to an increase in its receptors and endothelial dysfunction. At the same time, the artery favors cholinergic and β2-adrenergic relaxation as compensation for the decrease in nitric oxide-dependent relaxation. These modifications could favor a hypoxic environment in the tumor, thus feeding back signaling pathways such as VEGF/PTEN/GSK3B/NF-kB that facilitate tumor development and vascular adaptations. Based on this work, a research platform is established based on vascular adaptation mechanisms in cancer and where the pharmacological role of altered contraction/relaxation pathways could be explored. This thesis consists of six chapters and two annexes. Chapters two and three, and the annexes, are articles that were published with the main or co-authorship of Nelson Cupitra during his doctoral training. Chapters four and five are two more articles that will be submitted before the public defense of the thesis, with the main authorship of Nelson Cupitra. In total, with the four articles already published, this thesis adds an impact factor of 12.05. This thesis was defended on January 28, 2021 and qualified as summa cum laude (4.9 out of 5)