Terapia celular basada en astrocitos cdk5-kd en un modelo de isquemia cerebral

Abstract

RESUMEN: La isquemia cerebral, es una de las enfermedades cerebrovasculares más frecuentes, la cual tiene una alta incidencia de muerte, discapacidad física y mental en el mundo entero. Colombia como país en vía de desarrollo, posee una población vulnerable a esta patología, debido al incremento de los factores de riesgo como obesidad, enfermedades metabolicas, hipertensión entre otras. Actualmente, no existen tratamientos que puedan inducir una recuperación completa y a largo término de las funciones motoras, cognitivas y emocionales después del evento isquémico, lo cual, progresivamente puede desencadenar demencia vascular y/o neurodegeneración tipo Alzheimer. La excitotoxicidad, la liberación de radicales libres y la respuesta inmune exacerbada causa serias complicaciones en las áreas motoras y cognitivas post isquemia. Estas alteraciones, hacen necesario la búsqueda de tratamientos que permitan regular las alteraciones fisiopatológicas involucradas en este proceso. Una de las alternativas propuestas es la terapia celular. Esta involucra el uso de células que cumplan con características restaurativas, protectivas y homeostáticas que brinden una recuperación e impidan la progresión de la enfermedad. Una de estas células son los astrocitos los cuales están involucrados en un gran número de procesos claves en el sistema nervioso como: la regulación del tono vascular y angiogénesis en respuesta a la actividad neuronal, la remoción del exceso de glutamato de la hendidura sináptica, la regulación de la neurotransmisión, la formación, mantenimiento y regulación de la barrera hematoencefálica, la liberación de factores neurotróficos, la inmuno-modulación y la neurogénesis adulta. Por otro lado, otro factor importante para recuperación y la protección del tejido nervioso tras la isquemia cerebral, es el control de las proteínas que sufren alteraciones es su actividad una de estas proteínas es CDK5. A nivel fisiológico, esta quinasa está involucrada en funciones de células neuronales y no neuronales, como los astrocitos. Su sobreactivación está implicada en procesos neurodegenerativos asociados a taupatías y demencia vascular, como la enfermedad de Alzheimer. Por lo anterior, el objetivo central de esta investigación Andrea del Pilar Becerra Calixto. BCl. MSc 15 fue evaluar y validar la terapia celular con astrocitos modificados genéticamente con CDK5 RNAi, en un modelo in vivo para isquemia cerebral en ratas. Para ello, se evaluó el parénquima cerebral en respuesta al trasplante de astrocitos silenciados para CDK5 (CDK5-knockdown) en la corteza somatosensorial después de generar isquemia cerebral global en ratas. Ratas Wistar macho de tres meses de edad fueron sometidas a la oclusión de las arterias carótidas e inmediatamente les fueron trasplantados astrocitos con shCDK5miR, shSCRmiR y astrocitos sin modificación genética como controles. Nuestros hallazgos mostraron que un mes post tratamiento, los animales trasplantados con astrocitos shCDK5miR (CDK5-KD) recuperaron su capacidad neurológica y motora en comparación, con los animales trasplantados con astrocitos y con astrocitos shSCRmiR. A nivel histopatológico, la terapia celular con astrocitos evitó la perdida neuronal; los animales trasplantados con astrocitos CDK5-KD incrementaron significativamente la inmunorreactividad (IR) en células GFAP+ endógenas con una morfología arborizada, alrededor de vasos sanguíneos. Esta actividad fue acompañada del incremento de la IR de PECAM-1 en las paredes de los vasos sanguíneos en la corteza motora y somatosensorial, un incremento de la expresión de Ki67 en las regiones subventriculares y una secreción de factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF). Cuatro meses post isquemia, los animales CDK5-KD mostraron un mantenimiento de la neuroprotección, evitando la pérdida neuronal y astrocitaria. El análisis de IR para marcadores asociados a angiogénesis (PECAM-1 y Von Willebrand) y el mantenimiento de la barrera hematoencefálica (Claudina 5) mostraron una expresión vascular más asociada con el control sano (Sham). La IR de BDNF mostró un patrón de expresión astrocitaria en animales trasplantados con astrocitos CDK5-KD a diferencia de los animales control y trasplantados con astrocitos shSCRmiR y astrocitos cuya expresión fue neuronal; dichos efectos fueron apoyados por resultados in vitro de protección endotelial y neuronal en cocultivos en un modelo de excitoxicidad por glutamato. Adicionalmente, el silenciamiento de CDK5 en astrocitos, mostró un cambio parcial en los niveles de expresión de proteínas como Nestina, Dubleocortina, GFAP y Vimentina sugiriendo cambios en fenotipo de estas células probablemente relacionado con su estadio inmaduro, el cual debe ser más ampliamente Andrea del Pilar Becerra Calixto. BCl. MSc 16 estudiado. En conjunto los resultados sugieren que el trasplante de astrocitos CDK5-KD puede inducir una protección neurovascular endógena en ratas isquémicas, a través de la expresión de BDNF permitiendo una recuperación neurológica y motora, la cual puede ser sostenida a largo término.