Clonación, expresión y caracterización de la toxina de tres dedos Mipartoxin-I, Mayor componente tóxico del veneno de Micrurus mipartitus (serpiente coral rabo de ají)

Abstract

RESUMEN: Cinco secuencias precursoras para la familia de las alfa-neurotoxinas de cadena corta fueron identificadas a partir del ADNc de la glándula venenosa de la Micrurus mipartitus (serpiente coral rabo de ají). Entre ellas la secuencia precursora para la Mipartoxin-I, la Mipartoxin-Ia, isoforma de la anterior, y 3 proteínas más las cuales fuero denominadas Mipartoxin-II, Mipartoxin-III y Mipartoxin-IV. Estas secuencias codificaron para un propéptido de 79-82 aminoácidos, el cual contiene un péptido señal de 21 aminoácidos y un péptido maduro entre 58-61 aminoácidos. A partir de la secuencia codificante para la Mipartoxin-I, se clonaron tres constructos en el plásmido pPICzαC en Pichia pastoris cepa X33: Mipartoxin-IA (secuencia propéptido Mipartoxin-I), Mipartoxin-IB (secuencia Mipartoxin-I), y Mipartoxin-IC (secuencia Mipartoxin-I más epítopo c-myc y marcador de 6 histidinas). Sin embargo solamente la Mipartoxin-IC fue la que evidenció una producción aceptable con una concentración de 2-5 mg/L de proteína recombinante con una pureza de 95%. No obstante no mostró efecto letal en el modelo de ratón, pero indujo una leve toxicidad a 100ug/ratón. Por análisis de digestión con tripsina en gel por MALDI-TOF-TOF se confirmaron péptidos de la Mipartoxin-IC, igualmente por anticuerpos anti-His se confirmó la expresión de la proteína. Finalmente por migración en SDS-PAGE y LS/MSD se determinó que su masa molecular fue de 11.715 Da.