Estandarización de técnicas moleculares basadas en amplificación y análisis de restricción para la identificación de especies de Aspergillus spp

Abstract

RESUMEN: La implementación de las técnicas moleculares permitió la identificación y clasificación de las especies de Aspergillus en secciones, incorporando modificaciones en la taxonomía a partir de los análisis filogenéticos. Objetivos: Identificar aislamientos de Aspergillus spp. pertenecientes al banco de cepas de la escuela de Microbiología de la Universidad de Antioquia, mediante el empleo de los métodos moleculares PCR y PCR-RFLP. Métodos: Se realizó caracterización macroscópica y microscópica inicial de los aislamientos de Aspergillus spp., se eligieron 17 cepas de trabajo a las cuales se les realizó extracción de ADN genómico, posteriormente se estandarizaron las condiciones de trabajo de PCR y PCR-RFLP. Resultados: Se confirmó la morfología de las 17 cepas de Aspergillus, utilizando las claves para el género Aspergillus de Piontelli E. 2008. Para la amplificación por PCR se realizó inicialmente el proceso de estandarización de las condiciones de trabajo, mediante gradientes de temperatura realizados para cada par de cebadores (ITS1F/ITS4R, V9GF/LS266R, CaM2F/CaM2R y BTUBF/BTUBR), los resultados de la tipificación molecular por PCR para cada uno de los aislamientos presentó amplificación de ADNg para los 3 genes estudiados (β-tubulina, calmodulina y la región ITS), para gen de β-tubulina se obtuvieron bandas entre 549 y 574 pb para los aislamientos Afl2, Afl3, Af1, Acl2, At1 y At4, cuyos tamaños eran los esperados de acuerdo con la digestión in silico realizada, para calmodulina se observaron bandas de tamaños esperados entre 727 y 798 pb para los aislamientos Afl2, Afl3, Af1, And1, An2, At1 y At4, para el gen ITS1 los aislamientos Afl2, Afl3, Afl4, Af1, At4 y An2 presentan bandas de tamaños esperados entre 602 y 945 pb, finalmente la región ITS2 mostró amplificación en todos los aislamientos con tamaños de bandas esperados entre 965 y 1243 pb. La PCR-RFLP se utilizó como técnica complementaria a la PCR, con la finalidad de llevar la identificación hasta nivel de especie, la digestión de β-tubulina con TaqI genera bandas específicas para A. flavus (Afl3), A. fumigatus (Af1), A. terreus (At1), cuyos números de cortes coinciden con los esperados según la digestión in silico, en el caso de la digestión con calmodulina, se observó que una sola cepa presentó corte (Af1), generando tres perfiles con tamaños de banda de ~ 200, 280 y 290 pb, por último, la región ITS mostró patrones de diferenciación en las cepas A. fumigatus (Af1), A. versicolor (Av2) y A.hollandicus (Ah1). Conclusiones: Al complementarse la identificación molecular con la RFLP, de los tres genes estudiados, se concluye que los mejores resultados se obtuvieron con los genes β-tubulina digerido con la enzima Taq1, que discrimino un total de 3 especies: A. flavus (Afl3), A. fumigatus (Af1) y A. terreus (At1), e ITS1 con la enzima AvaII con las especies A. fumigatus, A.versicolor y A. hollandicus.

ABSTRACT: The implementation of molecular techniques allowed the identification and classification of Aspergillus species into sections, incorporating taxonomy modifications based on phylogenetic analyzes. Objectives: To identify isolates of Aspergillus spp. belonging to the strain bank of the School of Microbiology of the University of Antioquia, using the molecular methods PCR and PCR-RFLP. Methods: Initial macroscopic and microscopic characterization of the Aspergillus spp isolates was performed, 16 working strains were chosen to which genomic DNA extraction was performed, subsequently the working conditions of PCR and PCR-RFLP were standardized. Results: The morphology of the 17 strains of Aspergillus was confirmed, using the keys for the Aspergillus genus of Piontelli E. 2008. For PCR amplification, the process of standardization of working conditions was initially carried out, using temperature gradients performed for each pair of primers (ITS1F / ITS4R, V9GF / LS266R, CaM2F / CaM2R and BTUBF / BTUBR), the results of the PCR molecular typing for each of the isolates presented amplification of gDNA for the 3 genes studied (β-tubulin, calmodulin and ITS region), for bands of β-tubulin, bands between 549 and 574 bp were obtained for the Afl2, Afl3, Af1, Acl2, At1 and At4 isolates, the sizes of which were expected according to the in silico digestion performed, for calmodulin bands of expected sizes between 727 and 798 bp were observed for the Afl2, Afl3, Af1, And1, An2, At1 and At4 isolates, for the ITS1 gene the Afl2, Afl3, Afl4, Af1, At4 and An2 isolates have bands of expected sizes between 602 and 945 bp, finally the ITS2 region showed amplification in all isolates with expected band sizes between 965 and 1243 bp. The PCR-RFLP was used as a complementary technique to the PCR, in order to take the identification to species level, the digestion of β-tubulin with TaqI generates specific bands for A. flavus (Afl3), A. fumigatus (Af1) , A. terreus (At1), whose cutoff numbers coincide with those expected according to in silico digestion, in the case of calmodulin digestion, it was observed that a single strain presented a cut (Af1), generating three profiles with band sizes of ~ 200, 280 and 290 bp, finally, the ITS region showed differentiation patterns in strains A. fumigatus (Af1), A. versicolor (Av2) and A.hollandicus (Ah1). Conclusions: Upon complementing the molecular identification with the RFLP, of the three genes studied, it is concluded that the best results were obtained with the β-tubulin genes digested with the enzyme Taq1, which discriminated a total of 3 species: A. flavus (Afl3), A. fumigatus (Af1) and A. terreus (At1), and ITS1 with the enzyme AvaII with the species A. fumigatus, A.versicolor and A. hollandicus.