Determinación in vitro de la constante de disociación (Kd) del colorante Mag-Fluo-4, en presencia de Ca2+ y Mg2+

Abstract

RESUMEN: El adecuado control de las concentraciones de Calcio (Ca2+) intracelular es de vital importancia en el fenómeno de acoplamiento excitación-contracción (AEC) de músculo esquelético en mamíferos. La dinámica de estas concentraciones (i.e. sus valores en el tiempo) ha sido registrada de manera cuantitativa haciendo uso de indicadores fluorescentes de Ca2+ en fibras de músculo esquelético. Para esto es necesario conocer la constante de disociación (Kd) del indicador, la cual es una medida de la fuerza de la unión entre el colorante y los iones de Ca2+. Haciendo uso de la naturaleza fluorescente del colorante es posible cuantificar el Ca2+ libre en un compartimiento celular como el citoplasma. Esto puede ser determinado asumiendo stequiometrías Ca2+- Colorante de 1:1 y 1:2. Sin embargo, la competencia del Ca2+ con otros sitios de unión del colorante es uno de los fenómenos de interés actual en el estudio de la fisiología del músculo cardiaco y esquelético. En particular, la relativa abundancia del ion Mg2+ en el citoplasma genera especial interés para avanzar en el objetivo de tener una completa comprensión del fenómeno AEC. El presente trabajo de grado (en modalidad de investigación) abordó la pregunta ¿Cuál es el valor de K_d in vitro para Ca2+ del indicador fluorescente Mag-Fluo-4, y cómo cambia en presencia de Mg2+? Para dar respuesta se propuso determinar la K_d in vitro del colorante Mag-Fluo-4 en presencia de diferentes concentraciones de Ca2+ y Mg2+ y posteriormente comparar el efecto de este Kd sobre calibraciones con estequiometrías 1:1 y 1:2. Se prepararon soluciones en el laboratorio con la ayuda de un electrodo selectivo de Ca2+, sin embargo, no se obtuvieron resultados confiables con este proceso y se procedió a trabajar con 12 soluciones comerciales con concentraciones de Ca2+ libre entre 10 nM y 10 mM. Se llevaron a cabo mediciones a 20 °C con la técnica de espectrofluorimetría y la amplitud de las señales en función de la concentración de Ca2+ se ajustó con la ecuación sigmoidea de Boltzmann. Se obtuvo un valor de Kd = 111,9 µM. En las calibraciones para estequiometrías 1:1 y 1:2 se obtuvieron concentraciones citoplasmáticas de Ca2+ de ~11 µM y ~0,037 µM, respectivamente. Se concluye que no es confiable usar soluciones preparadas en nuestro laboratorio aún, por causas externas como agua con altas concentraciones de Ca2+, que el alto valor de Kd obtenido confirma la baja afinidad del colorante por Ca2+ y que la estimación de la concentración citoplásmica de Ca2+ depende fuertemente de la estequiometría de la reacción Ca2+-colorante.