Actividad antiviral in vitro e in silico de compuestos isoprenoides contra los virus Dengue, Chikungunya y Zika

Abstract

RESUMEN: Introducción: No existe un tratamiento antiviral específico disponible contra los virus Dengue (DENV), Chikungunya (CHIKV) y Zika (ZIKV). El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad antiviral in vitro e interacciones in silico de cuatro compuestos isoprenoides aislados a partir de las plantas T. cymosa Jacq., C. ambrosioides L. y C. odoratissima Jacq. recolectadas en la Región Caribe colombiana contra DENV-2, CHIKV y ZIKV. Metodología: Se evaluó la viabilidad de células VERO en presencia de Alfa-Espinasterol, Lupeol, Estigmasterol y Friedelina por la técnica de MTT (7,3 – 242,3 μM). Una vez definida una concentración no citotóxica en células VERO, esa única concentración se evaluó en células U937 y A549 por la técnica de MTT. Inicialmente, el efecto antiviral de los isoprenoides se evaluó mediante cuatro estrategias diferentes en células VERO: (i) tamizaje antiviral, (ii) PRE-tratamiento, (iii)TRANS-tratamiento y (iv) POST-tratamiento, usando los aislados clínicos CHIKV/ACol y ZIKV/Col y las cepas de referencia DENV-2/NG y DENV-2/16681 (MOI 1). Los porcentajes de infección fueron calculados mediante tres técnicas: Ensayo de plaqueo, RT-qPCR (Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) y CELL-ELISA. Posteriormente, y de acuerdo a los resultados obtenidos en células VERO, se evaluaron algunas estrategias en células U937 y A549. Como control positivo de inhibición se usó Suramina, Heparina y/o Ribavirina. Por otro lado, se secuenció el gen de la envoltura de DENV-2/NG y DENV-2/16681 por el método de Sanger y se establecieron las diferencias nucleotídicas y aminoacídicas por el método de Clustal W. Para las evaluaciones In silico, se evaluó la interacción de los isoprenoides con las proteínas E y NS5 de DENV y ZIKV, y E y NSP2 de CHIKV, mediante docking molecular y dinámica molecular. Resultados: La viabilidad de células VERO en presencia de los cuatro isoprenoides fue superior al 70,0 % a concentraciones menores o iguales de 117,2 μM de Alfa-Espinasterol, Lupeol y Estigmasterol y 29,3 μM de Friedelina. Se demostró el potencial antiviral del Alfa- contra DENV-2/NG (porcentaje de infección del 40,9 %) mediante el tamizaje antiviral en VERO, el potencial virucida contra DENV-2/NG y DENV-2/16681 (porcentajes de infección del 65,6 % y 44,1 %, respectivamente) y la actividad antiviral contra ZIKV/Col mediante la estrategia de PRE- tratamiento en VERO y U937 (Porcentaje de infección del 44,8 % y 42,9 %, respectivamente). Lupeol demostró un potencial virucida contra DENV-2/NG y DENV-2/16681 (porcentajes de infección del 43,0 % y 54,2 %, respectivamente), un efecto antiviral contra CHIKV/Acol mediante las estrategias de PRE- tratamiento, TRANS-tratamiento y POST-tratamiento en VERO (porcentajes de infección del 32,7 %, 11,7 % y 0,8 %, respectivamente) y provocó disminución del número de copias genómicas de CHIKV en A549 (porcentaje de infección del 37,1 %), pero no afectó proteína viral (porcentaje de infección del 81,7%). Lupeol afectó etapas iniciales del ciclo replicativo de ZIKV/Col en VERO (porcentaje de infección del 30,7 %). Estigmasterol demostró un potencial virucida contra DENV-2/16681 (porcentaje de infección del 50,2 %), afectó etapas iniciales del ciclo replicativo de CHIKV/Acol y ZIKV/Col en VERO (porcentajes de infección del 12,8 % y 39,3 %, respectivamente) y U937 (porcentajes de infección del 44,2 % contra CHIKV y 50,9 % contra ZIKV). Friedelina demostró un posible efecto virucida contra DENV-2/NG y CHIKV (porcentajes de infección del 62,4 % y 15,7 %, respectivamente). Se identificaron seis cambios nucleotídicos entre las secuencias del gen de envoltura de DENV-2/NG y DENV-2/16681, y cuatro mutaciones no sinónimas. Finalmente‚ las proteínas E y NS5 de DENV y ZIKV, y E y NSP2 de CHIKV, interactuaron con los cuatro isoprenoides con una energía de libre de unión entre -5.3 y -9.6 Kcal/mol. El mejor complejo de interacción de la proteína E de DENV y Lupeol, fue estable durante 6,5 ns de simulación. Conclusiones: Los cuatro isoprenoides evaluados en este estudio demostraron potencial antiviral in vitro contra DENV-2, ZIKV y/o CHIKV. El efecto antiviral fue dependiente de línea celular, modelo viral y cepa infectante. Este es el primer trabajo que reporta actividad antiviral del Alfa-Espinasterol y Friedelina. El Lupeol demostró actividad contra todos los virus evaluados, mediante las diferentes estrategias usadas, por lo que es el isoprenoide con potencial antiviral más promisorio de este trabajo, principalmente contra CHIKV

ABSTRACT: Introduction: There is no specific antiviral treatment available against Dengue (DENV), Chikungunya (CHIKV) and Zika (ZIKV) viruses. The aim of this work was to evaluate the in vitro antiviral activity and in silico interactions, of four isoprenoid compounds isolated from the plants T. cymosa Jacq., C. ambrosioides L. and C. odoratissima. Jacq collected in the Colombian Caribbean Region against DENV-2, CHIKV and ZIKV. Methodology: The viability of VERO cells in presence of Alpha-Spinasterol, Lupeol, Stigmasterol and Friedelin was assessed by the MTT assay (from 7.3 to 242.3 μM). Once a non-cytotoxic concentration in VERO cells was defined, that single concentration was evaluated in U937 and A549 cells by the MTT assay. Initially, the antiviral effect of the four isoprenoids was evaluated by four different strategies in VERO cells: (i) antiviral screening, (ii) PREtreatment, (iii) TRANS-treatment and (iv) POST-treatment, using thet clinical isolates CHIKV/ACol and ZIKV/Col, and reference strains DENV-2/NG and DENV-2/16681 (MOI 1). The infection percentages were calculated using three techniques: plaque assay, RT-qPCR (Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) and CELL-ELISA. Subsequently, and according to the results obtained in VERO cells, some strategies were evaluated in U937 and A549 cells. Suramine, Heparin and/or Ribavirin were used as positive inhibition control. The envelope gene of DENV-2/NG and DENV-2/16681 was sequenced by Sanger method and the nucleotide and amino acid differences were established by the method of Clustal W. For the in silico evaluations, the interaction of the isoprenoids with proteins E and NS5 of DENV and ZIKV, and E and NSP2 of CHIKV was evaluated by molecular docking and molecular dynamics. Results: The viability of VERO cells in the presence of the four isoprenoids was greater than 70.0 %, at concentrations less than or equal to 117.2 μM of Alpha-Spinasterol, Lupeol and Stigmasterol, and 29.3 μM of Friedelin. The antiviral potential of Alpha-Spinasterol was demonstrated by the antiviral screening against DENV2/NG (percentage of infection of 40.9 %), the virucidal potential against DENV-2/NG and DENV-2/16681 (percentages of infection of 65.6 % and 44.1 %, respectively) and the antiviral activity against ZIKV/Col through a PRE-treatment strategy in VERO and U937 cells (percentages of infection of 44.8 % and 42.9 %, respectively). Lupeol demonstrated a virucidal potential against DENV-2/NG and DENV-2/16681 (percentages of infection of 43.0 % and 54.2 %, respectively), and an antiviral effect against CHIKV/ACol through PRE-treatment, TRANStreatment and POST-treatment in VERO cells (percentages of infection of 32.7 %, 11.7 % and 0.8 %, respectively), and Lupeol caused a decrease in the number of genomic copies of CHIKV/ACol in A549 cells (percentages of infection of 37.1 %); but it did not affect viral protein (percentages of infection of 81.7 %). Lupeol also affected initial stages of the replicative cycle of ZIKV/Col in VERO cells (percentages of infection of 30.7%). Stigmasterol demonstrated a virucidal potential against DENV-2/16681 (percentages of infection of 50.2 %), affected initial stages of the replicative cycle of CHIKV/ACol and ZIKV/Col in VERO (percentages of infection of of 12.8 % and 39.3 %, respectively) and U937 cells (percentages of infection of 44.2 % against CHIKV/ACol and 50.9 % against ZIKV/Col, respectively). Friedelina demonstrated a possible virucidal effect against DENV-2/NG and CHIKV/ACol (percentages of infection of 62.4% and 15.7%, respectively). Six nucleotide changes were identified between the envelope gene sequences of DENV-2/NG and DENV-2/16681, and four non-synonymous mutations. Finally, the E and NS5 proteins of DENV and ZIKV, and E and NSP2 of CHIKV/ACol, interacted with the four isoprenoids with a binding-free energy between -5.3 and -9.6 Kcal/mol. The best DENV and Lupeol protein E interaction complex was stable for 6.5 ns of simulation. Conclusions: The isoprenoids evaluated demonstrated in vitro antiviral potential against DENV-2, ZIKV and/or CHIKV. The antiviral effect was dependent on cell line, viral model and viral strain. This is the first work that reports antiviral activity of Alpha-Spinasterol and Friedeline. Lupeol demonstrated activity against all viruses evaluated, through the different strategies used, making it the most promising isoprenoid with antiviral potential of this work, mainly against CHIKV