MicroRNAs celulares reguladores de proteínas blanco de la acción de E6 y E7 del VPH como potenciales biomarcadores de lesiones preneoplásicas de alto grado de cérvix

Abstract

RESUMEN. El cáncer cervical ocupa el primer lugar en mortalidad por cáncer en mujeres de los países de bajos y medianos ingresos, donde se produjo el 80% de los 570,000 casos y 311,000 muertes en el mundo, estimadas para 2018. La infección persistente con genotipos de alto riesgo del virus del papiloma humano (VPH-AR) puede conducir a lesiones de alto grado (NIC-2 +), que si no se tratan progresan a cáncer. La prueba de VPH-AR tiene alta sensibilidad, pero dado que muchas mujeres infectadas eliminarán la infección espontáneamente, tiene baja especificidad para detectar NIC-2+. Los miRNA regulan la expresión génica a nivel postranscripcional y han mostrado perfiles diferenciales en el espectro de la enfermedad. Objetivo. Identificar miRNAs reguladores de proteínas diana de E6/E7 del VPH-AR, expresados diferencialmente entre lesiones de alto grado y lesiones de bajo grado del cérvix, en mujeres VPH-AR+. Métodos. Se buscaron miRNAs in-sílico con la estrategia basada en proteínas dianas de E6/E7 del VPH-AR. Se comparó el patrón de expresión de miRNAs entre tejidos fijado en formalina e incluido en parafina (TFFIP) VPH-AR+, con lesiones de bajo grado (n = 10) y lesiones de alto grado (n = 10) con datos de smallRNAseq y validamos cinco miRNAs por qRT-PCR en un grupo independiente de 50 TFFIP. Análisis exploratorios de curvas ROC se usaron para calcular el AUC de los miRNAs para la detección de NIC-3. Resultados. Se identificaron 454 miRNAs reguladores de alguno de los 19 genes que codifican para proteínas dianas de E6/E7. Por secuenciación se obtuvieron 162 miRNA diferencialmente expresados entre lesiones de alto grado y bajo grado, de los cuales 47 fueron predichos in-sílico. La expresión relativa de cinco miRNAs por qRT-PCR, fue mayor entre alto grado y bajo grado (p < 0,05) y los niveles de miR-2, 3 y 4 aumentaron con la progresión de la enfermedad (sano, NIC 1, NIC 2, NIC 3 +). Los mayores FC fueron obtenidos por el miR-1, 2 y 3, de 19.3, 10 y 9.4 respectivamente, en secuenciación, y de 16.8, 6.7 y 6.7 respectivamente, por qRT-PCR, entre alto y bajo grado (p < 0,05). El coeficiente de correlación de Pearson entre smallRNAseq y qRT-PCR fue 0.86. El miR-3 y su combinación con miR-1 obtuvo el mayor AUC de 79,09 % para la detección de NIC 3+. En conclusión, se identificaron 162 miRNA por secuenciación, de los cuales 47 regulan transcritos que codifican para proteínas diana de E6/E7, a su vez cinco de estos miRNAs (miR-1, 2, 3, 4 y 5) fueron validados por qRT-PCR mostrando que miRNAs reguladores de transcritos, cuyos genes codifican para proteínas diana de E6/E7, están alterados entre lesiones de alto grado y bajo grado. Se necesita una validación adicional en una cohorte de muestras más grande para confirmar el potencial de estos miRNA para clasificar mujeres VPH-AR+

ABSTRACT: Cervical cancer ranks first in cancer mortality among women of low-middle income countries where 80% of the 570,000 cases and 311,000 worldwide deaths estimated for 2018 occurred. Persistent infections with high-risk HPV (hrHPV) genotypes can lead to cervical high-grade lesions (Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade 2 or more severe disease (CIN II+), that if left untreated progress to cancer. hrHPV test has high sensitivity but because many women infected with hrHPV genotypes will clear the infection spontaneously, it has low specificity to detect CIN II+. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that regulate gene expression and show differential profiles in cervical intraepithelial lesions. Aim. Identify miRNAs that regulated target proteins of E6/E7 of hrHPV, differentially expressed in high- versus low-grade lesions from hrHPV infected women. Methods. miRNAs were searched in-sílico using the strategy based on hrHPV- E6/E7 target proteins. We compared the miRNAs expression pattern between FFPE tissues from hrHPV infected women with low-grade lesions (n=10) and with high-grade lesions (n=10), using smallRNAseq, and five miRNAs were further validated by qRT-PCR (miR-1, 2, 3, 4 and 5) in an independent set of tissues FFPE (n=50). ROC analyses were used to calculate the AUC of the five miRNA and their combinations for NIC3 detection. Results. We identified 454 miRNAs regulated by some of the 19 target proteins of E6/E7. The smallRNAseq analysis identified 162 miRNAs differential expressed in high- versus low-grade lesions. Of which 47 were predicted in-sílico. The relative expression by qRT-PCR of five miRNAs was higher in high-grade versus low-grade (p < 0,05), and the levels of miR-2, 3 and 4 increased with disease progression (from healthy, CIN I, CIN II, CIN III+). The highest FC were obtained by miR-1, 2 and 3, of 19.3, 10 y 9.4 respectively, in the sequencing, and of 16.8, 6.7 y 6.7 respectively, by qRT-PCR, in high- versus low-grade lesions (p < 005). The Pearson’s correlation coefficient, R, between NGS analysis and qRT-PCR results was 0.86. ROC analysis exploration showed that miR-3 and its combination with miR-1 exhibit the highest AUC of 79 % (95% CI: 65-93). In conclusion, we identified 162 miRNAs by sequencing, of which 47 regulate some of the 19 target proteins of E6/E7, and we validated five by qRT-PCR. These results show that miRNAs that regulate target proteins of E6/E7; are expressed differently in high- versus low-grade lesions. Further validation on a larger cohort of samples is needed to confirm the potential role of these miRNAs to triage hrHPV infected women